順鉑誘導DNA損傷的核蛋白組學研究和microRNA分析.pdf

1、背景:應(yīng)用在卵巢癌、睪丸癌、膀胱癌、頭頸癌、官頸癌和肺癌等癌癥化療中的順鉑，是臨床上經(jīng)典的抗癌藥，存在已經(jīng)有30多年的歷史。順鉑主要的靶標是DNA。順鉑進入細胞后發(fā)生水化，與DNA交聯(lián)，由于加合而變形的DNA結(jié)構(gòu)，不能進行正常的復制，繼而觸發(fā)了死亡過程，這種DNA—Pt加合物被認為是引起細胞毒性主要原因。
　　 由于順鉑雖然在癌癥治療中效果顯著，抗性問題和副作用問題，這也成為順鉑臨床治療的瓶頸。正是對順鉑藥物作用機理的研究深入，

2、才出現(xiàn)了后續(xù)二代鉑類藥Oxaliplatin，不會和順鉑產(chǎn)生交叉抗性，以及正在臨床三期實驗的Satraplatin。說明只有不斷地了解順鉑作用機理及抗性產(chǎn)生機制，才能為臨床藥物設(shè)計提供新的策略。目前對順鉑作用機制的研究已很多，但仍有許多問題尚不明確。系統(tǒng)生物學技術(shù)作為高通量的分析方法，可以揭示一些未知或未預期的關(guān)聯(lián)。因此，本研究首先采用了蛋白組學方法分析細胞對順鉑的應(yīng)答反應(yīng)。
　　 考慮到順鉑主要靶標是DNA，DNA損傷后的修復

3、也是發(fā)生在細胞核內(nèi)，在本研究中，我們單獨提取了細胞的核蛋白，利用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D—PAGE)配合蛋白質(zhì)譜鑒定分析核內(nèi)蛋白組的變化。
　　 此外，MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，可調(diào)控60％哺乳動物的mRNA，繼而調(diào)控蛋白的變化。有研究表明，P53不但調(diào)控一些miRNAs，也被某些miRNAs所調(diào)控。鑒于DNA損傷后P53和miRNAs的緊密聯(lián)系，我們推測m

4、iRNAs可能也參與順鉑誘導的DNA損傷反應(yīng)過程中。本研究的第二部分就是利用了另外一種高通量技術(shù)——microRNAs表達譜芯片，從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后水平以外的另一個層次——轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，探究了順鉑誘導DNA損傷中microRNAs可能發(fā)揮的作用。
　　 第一部分
　　 目的:利用雙向電泳技術(shù)研究順鉑處理HeLa細胞后，細胞核內(nèi)蛋白組發(fā)生的變化，借以挖掘在DNA損傷后細胞一系列應(yīng)答過程中發(fā)揮作用的蛋白。
　　 方法:

5、
　　 1．細胞存活率及DNA損傷的檢測，包括Trypan Blue，MTT和免疫熒光及熒光強度的軟件分析；
　　 2．細胞核蛋白的提取和超濾法純化和濃縮蛋白，蛋白BCA和Bradford法定量；
　　 3．雙向電泳聯(lián)合質(zhì)譜鑒定；
　　 4．Western Blot和熒光實時定量PCR驗證雙向結(jié)果；RNAi技術(shù)進行功能鑒定；流式細胞儀檢測RNAi后細胞凋亡和DNA損傷；
　　 結(jié)果:
　　

6、 1．隨著時間延長和濃度的增大，順鉑的細胞毒性和作為DNA雙鏈斷裂標志的γH2AX的形成具有明顯的時間效應(yīng)和濃度效應(yīng)；
　　 2．順鉑5μM處理HeLa細胞24 h后，細胞周期明顯停滯在S期，其比例從35％上升到86％，相應(yīng)地，G1期從54％下降到2％，G2期的比例沒有發(fā)生大的變化，僅從19％下降到12％；順鉑處理組的凋亡比例也從5．7％增加到17．5％；
　　 3．順鉑處理HeLa細胞后，在不同時間點通過雙向電泳圖譜比

7、較發(fā)現(xiàn)共有98個點發(fā)生改變。進一步質(zhì)譜鑒定出28個核蛋白點；在這28個核蛋白中，有6個是不同處理組共有的，剩下的22個蛋白在順鉑處理后表達量上調(diào)的有12個，表達量下調(diào)的有10個；
　　 4．用定量PCR，Western blot和免疫熒光方法驗證了雙向結(jié)果中Annexin Al，LaminB1和Hsp27蛋白表達的改變；
　　 5．對Annexin Al進行了進一步的功能鑒定，首先用免疫熒光的方法，直觀地觀察ANXAl干

8、擾后，對γH2AX焦點形成的影響。在5μM順鉑處理組中，與對照組相比，干擾組的γH2AX熒光的熒光強度明顯增加；用Western Blot和流式細胞術(shù)，檢測ANXAl干擾后對細胞DNA損傷的影響，其結(jié)果和免疫熒光結(jié)果一致。
　　 6．在干擾Annexin Al表達后，發(fā)現(xiàn)干擾組的自發(fā)凋亡比例(37．9％)已高于對照組(23．7％)。順鉑處理后，干擾組和對照組的凋亡比例沒有明顯差別，分別為54％和52％。
　　 結(jié)論:

9、r>　　 1．隨著時間延長和濃度的增大，順鉑的細胞毒性和γH2AX的形成具有明顯的時間效應(yīng)和濃度效應(yīng)；
　　 2．質(zhì)譜鑒定出28個核蛋白點，主要參與miRNA生物合成，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，mRNA加工，轉(zhuǎn)運，剪接，細胞周期和分裂，染色體分離，核纖層組成，細胞應(yīng)答反應(yīng)，細胞凋亡等過程。
　　 3．Annexin Al干擾后，自發(fā)凋亡顯著上升，順鉑誘導的DNA損傷加重。
　　 第二部分
　　 目的:研究順鉑處理誘導D

10、NA損傷的miRNA表達譜改變，從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后水平以外的另一個層次——轉(zhuǎn)錄后調(diào)控系統(tǒng)，揭示順鉑可能的作用機制和細胞應(yīng)答反應(yīng)過程。
　　 方法:提取總RNA(包含microRNAs)；Bioanalyzer分析純度，Nanodrop測定濃度，芯片檢測，挑選一批miRNAs進行Real time PCR驗證；利用轉(zhuǎn)染，免疫熒光，流式細胞儀，Western blot明確篩選出的miR—191與DNA損傷的關(guān)系。
　　 結(jié)果

11、:
　　 1．芯片檢測發(fā)現(xiàn)在順鉑處理后有40個發(fā)生了顯著改變，并對其中13個miRNAs進行了Real—time PCR驗證。
　　 2．對鑒定出的miR—191進行了深入研究。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了miR—191mimic的HeLa細胞在順鉑處理12 h和24 h后細胞生存率較對照顯著下降；說明miR—191使HeLa細胞對順鉑更敏感。
　　 3．在轉(zhuǎn)染了miR—191mimic的HeLa細胞中，已有部分細胞的細胞核被γH

12、2AX充滿，而對照組的γH2AX形成較少；經(jīng)過5μM順鉑處理24 h后，轉(zhuǎn)染了miR—191mimic組大部分細胞的細胞核充γH2AX，而此時的對照組，僅有少量的細胞核有γH2AX熒光分布。用軟件分析了γH2AX的平均熒光強度發(fā)現(xiàn)，順鉑處理24 h后，與對照組比較，轉(zhuǎn)染了miR—191mimic組細胞γH2AX的平均熒光強度顯著增加。
　　 4．利用流式細胞儀和Western Blot進一步確認發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象。流式細胞計數(shù)檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)