莪術(shù)二酮抑制凝血酶誘導(dǎo)血小板活化的蛋白組學(xué)研究.pdf

1、血栓是血液成分在血管或者心臟內(nèi)膜表面形成的血液凝塊或沉積物，可以發(fā)生在血液中的任何地方導(dǎo)致血液流動(dòng)停止。在生理情況下，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞血管壁受到損傷后，血小板隨之附著，導(dǎo)致血小板激活，引起血小板聚集，可發(fā)揮止血作用并且修復(fù)損傷部位。然而，在病理情況下，血小板發(fā)生不正常的或過(guò)度的活化可能會(huì)在損傷的部位過(guò)度聚集進(jìn)行形成血栓成為心腦血管疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。由此可見(jiàn)，血栓的形成與血小板活化和聚集密切相關(guān)。
　　現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，從溫郁金中提取的莪術(shù)二酮

2、具有顯著的抗凝血，抗血栓形成的作用。當(dāng)給予四種誘導(dǎo)劑刺激血小板活化時(shí)，發(fā)現(xiàn)莪術(shù)二酮對(duì)于凝血酶誘導(dǎo)的血小板活化具有顯著的抑制作用，那么莪術(shù)二酮抑制血小板激活的作用靶點(diǎn)是什么呢？蛋白質(zhì)組學(xué)作為一種高通量篩選技術(shù)，已經(jīng)在尋找藥物對(duì)疾病的靶點(diǎn)蛋白，比較蛋白功能水平上被廣泛應(yīng)用，而由于血小板無(wú)核，病人血小板功能的異常幾乎完全歸因于蛋白表達(dá)的變化翻譯后修飾的動(dòng)態(tài)差異，而血小板的蛋白組學(xué)只需要少量毫升的血液就能揭示蛋白質(zhì)的翻譯后修飾以及蛋白間的相互作

3、用，而非標(biāo)記定量主要是對(duì)酶解后的肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析比較從而對(duì)蛋白進(jìn)行相對(duì)定量，于是課題組采用了非標(biāo)記定量的蛋白組學(xué)方法進(jìn)行了莪術(shù)二酮對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的血小板激活的抑制作用可能機(jī)制的探討。本研究實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下：
　　目的：本研究主要觀察莪術(shù)二酮作用于血小板后蛋白表達(dá)譜的改變情況，探討莪術(shù)二酮抑制血小板活化的可能機(jī)制，并找到具體的作用靶點(diǎn)來(lái)解釋作用機(jī)制。
　　方法：首先采用透射電鏡實(shí)驗(yàn)觀察莪術(shù)二酮對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的人血小板活化的抑制作用，抽

4、取健康志愿者血小板，洗滌后，分為生理鹽水組，凝血酶誘導(dǎo)組以及莪術(shù)二酮孵育組，數(shù)步處理后觀察不同組別的血小板內(nèi)α顆粒的釋放情況。為進(jìn)一步闡明莪術(shù)二酮抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集的作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)建立了三組血小板蛋白的液質(zhì)分析總離子流圖譜，將Nano ESI-LC-MS/MS得到的數(shù)據(jù)用 Sequest HT引擎搜庫(kù)，利用 Proteome Discoverer1.3軟件鑒別各組血小板總蛋白，采用UniProt分析軟件分析蛋白。鑒別后的蛋白利

5、用ChromAlign軟件整合，使用SIEVE1.3軟件鑒別不同組之間的差異蛋白。使用IPA和PANTHER等生物信息學(xué)方法搜索差異蛋白之間的互作網(wǎng)絡(luò)以及參與的信號(hào)通路。利用Western blotting方法驗(yàn)證蛋白組學(xué)結(jié)果以及添加抑制劑來(lái)驗(yàn)證可能的信號(hào)通路與作用靶點(diǎn)。
　　結(jié)果：透射電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示100μM莪術(shù)二酮能夠明顯抑制0.3 U凝血酶引起的血小板內(nèi)α顆粒的釋放。蛋白組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水組相比，凝血酶組有22個(gè)差異

6、蛋白，其中有8個(gè)蛋白上調(diào)，14個(gè)蛋白下調(diào)。與凝血酶組相比，莪術(shù)二酮組有兩個(gè)差異蛋白，Talin1和β1-tubulin在莪術(shù)二酮處理后顯著下調(diào)。生物信息學(xué)結(jié)果提示差異表達(dá)蛋白質(zhì)與細(xì)胞進(jìn)程，生物粘附以及生物發(fā)展有關(guān),主要參與了整合素信號(hào)通路。Western blotting驗(yàn)證差異蛋白表達(dá)水平與蛋白組學(xué)結(jié)果相同。抑制β1-tubulin的表達(dá)能夠抑制vinculin/talin1的蛋白表達(dá)水平，同時(shí)能夠抑制血小板內(nèi)α顆粒的釋放。