局部用辣椒堿傳遞體的研究.pdf

1、目的：辣椒堿是從茄科植物辣椒CapsicumfrutescensL.的果實(shí)中分離的辛辣物質(zhì)——辣椒素的主要成分。辣椒素在辣椒中的含量為0.1％～1％，其中有五種組成物的含量之和已接近100％，包括辣椒堿約69％，二氫辣椒堿約22％，降二氫辣椒堿約7％，高二氫辣椒堿約1％。 在醫(yī)學(xué)上，辣椒堿顯示了廣泛的生理活性，包括抗高血壓、降血脂。局部應(yīng)用辣椒堿也可以治療各種疾病，例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、肌肉疼痛、背痛、撞傷、拉傷、扭傷，以

2、及糖尿病性神經(jīng)痛、帶狀泡疹后遺神經(jīng)痛、三又神經(jīng)痛、過敏性鼻炎、牛皮癬等。辣椒堿止痛的作用機(jī)理主要是耗竭神經(jīng)介質(zhì)P物質(zhì)。由于P物質(zhì)被耗蝎，神經(jīng)元變得遲鈍，對(duì)外周傷害性刺激脫敏。神經(jīng)元脫敏是辣椒堿治療作用的基礎(chǔ)。 但由于辣椒高度的肝首過效應(yīng)及非常短的半衰期，經(jīng)皮給藥能繞過肝臟及維持平穩(wěn)的血藥濃度，是辣椒堿發(fā)揮全身及局部作用合適的給藥系統(tǒng)。目前，市場(chǎng)上辣椒堿局部產(chǎn)品，包括霜?jiǎng)?、貼片及橡皮膏劑，均在應(yīng)用部位有明顯灼痛感，導(dǎo)致皮膚紅斑。同

3、時(shí)，皮膚角質(zhì)層對(duì)藥物的透皮吸收具有阻礙作用，因此，消除辣椒堿的不良反應(yīng)并保留其功效是研究開發(fā)辣椒堿臨床應(yīng)用的主要目標(biāo)。 目前，提高藥物透過皮膚角質(zhì)層的方法包括微粒載體(泡囊、微乳、類脂毫微粒等)，化學(xué)促進(jìn)劑(氮酮、揮發(fā)油等)，物理促滲技術(shù)(離子導(dǎo)入、電穿孔、超聲波等)。其中，各種泡囊載體以其毒性小、不對(duì)皮膚造成傷害，促進(jìn)各種性質(zhì)藥物(脂溶性、水溶性、大分子)穿過皮膚角質(zhì)層而備受注目。新型泡囊——傳遞體(transfersomes

4、)具有高度變形與彈性，能穿過比其自身小數(shù)倍的孔道，比傳統(tǒng)脂質(zhì)體有更高的皮膚滲透性已得到廣泛的認(rèn)同。 本文采用傳遞體(transfersomes)包裹辣椒堿以減少局部應(yīng)用帶來毒副反應(yīng)，同時(shí)，增加透皮作用。內(nèi)容包括辣椒堿的提取、分離與純化，辣椒堿傳遞體制各，動(dòng)物、人體皮膚體內(nèi)外滲透性及藥效學(xué)評(píng)價(jià)。 方法：(1)辣椒堿提取分離與純化。以河北定州王為原料，70％乙醇，回流提取2次，每次2h提取辣椒堿類化合物及辣椒色素，并采用HP

5、LC法測(cè)定其辣椒堿類含量。乙醇提取液減壓濃縮成浸膏，用2％NaOH溶液溶解，控制溶液的pH為11，離心(2000rpm，15mmin)，分離上清液。用石油醚自上清液中萃取辣椒色素。殘留的堿水液中加入10％HCl，調(diào)節(jié)溶液的pH至3，加入乙酸乙酯萃取辣椒堿類化合物。以硅膠G為層析材料，洗脫劑為石油醚及丙酮(3∶1)，分離辣椒堿及二氫辣椒堿。再經(jīng)反向硅膠柱層析，以洗脫劑為甲醇及水(7∶3)分離辣椒堿。 (2)辣椒堿傳遞體的制備及結(jié)構(gòu)

6、大小、包封率測(cè)定。采用薄膜分散法、薄膜-高壓勻質(zhì)法及滴入-高剪切分散法制備辣椒堿傳遞體，透射電鏡及zetasizer激光光子粒度儀測(cè)定傳遞體結(jié)構(gòu)及大小，葡聚糖G50微型凝膠測(cè)定包封率，并對(duì)操作條件，包括影響包封與未包封藥物分離的因素，即微柱中水量、離心轉(zhuǎn)速及時(shí)間等的影響進(jìn)行了研究。葡聚糖充分溶脹后填入5ml注射劑針筒中制成微柱，離心(1000rpm，6s)，除去葡聚糖凝膠微柱中部分水分，將0.4ml辣椒堿傳遞體滴加到柱中以后，離心(20

7、00rpm，5min)，分離包封及未包封辣椒堿，一階導(dǎo)數(shù)法扣除背景干擾測(cè)定辣椒堿傳遞體包封率。以包封率的改變、聚集及顏色為指標(biāo)，考查辣椒堿傳遞體在4℃，25℃，37℃，相對(duì)濕度75％，貯存6個(gè)月的穩(wěn)定性。 (3)辣椒堿傳遞體釋放度與體外皮膚滲透性。辣椒堿從傳遞體的釋放速度用Franz擴(kuò)散池測(cè)定。以50％乙醇-生理鹽水為接受液，供藥池一側(cè)加入含辣椒堿500μg的傳遞體，在32℃、攪拌速速為500r.min-1接受池條件下進(jìn)行釋放度

8、實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)散池與供給池之間為纖維素膜(截留分子量8000-14000)，擴(kuò)散池面積2.92cm2。在第2、4、6、8、10、12、24h定時(shí)取樣0.5ml，立即補(bǔ)充等量的新鮮介質(zhì)，樣品采用前述HPLC測(cè)定。體外透皮試驗(yàn)同釋放度，用小鼠、大鼠或人體腹部皮膚替代半透膜。皮膚的角質(zhì)面面向供給池，真皮面面向接受池。 (4)辣椒堿傳遞體局部皮膚應(yīng)用后體內(nèi)組織分布。單劑量或多劑量局部應(yīng)用辣椒堿傳遞體及腹腔注射辣椒堿注射劑后辣椒堿在血漿、后大腿

9、的皮膚、肌肉及骨胳的分布采用大鼠為動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。用含6％Na2S的脫毛液將大鼠一只后大腿的毛脫掉，讓其恢復(fù)24h。相當(dāng)于500μg辣椒堿的辣椒堿傳遞體涂于該側(cè)大腿，面積約3cm2，大鼠單獨(dú)放到鼠籠中防止藥物流失。注射給藥是腹腔注射相當(dāng)于500μg辣椒堿的辣椒堿注射液。在設(shè)定的時(shí)間間隔(注射給藥0.5、1、1.5、2、4、6h，局部給藥2、4、6、8、10、12h)從頸靜脈取血4ml，然后斷頸處死大鼠，分離大腿的皮膚、肌肉及骨胳。離心

10、分離血漿，其他組織勻漿處理。所有組織用HCl調(diào)節(jié)pH3，然后用正已烷萃取，正已烷萃取液直接用熒光分光光度法測(cè)定其中辣椒堿。除給藥方式不同，多劑量的處理方法與單劑量處理方法相同。 (5)辣椒堿傳遞體局部應(yīng)用藥效學(xué)及毒理學(xué)評(píng)價(jià)。采用KM小白鼠熱板和扭體法模型，評(píng)價(jià)單劑量辣椒堿傳遞體不同劑量鎮(zhèn)痛效果，并與口服與注射給藥進(jìn)行比較。采用KM小白鼠熱板和扭體法模型、二甲苯所致小鼠耳廓腫脹及毛細(xì)血管通透性增高模型，評(píng)價(jià)多劑量局部應(yīng)用辣椒堿傳遞

11、體的鎮(zhèn)痛抗炎效果。實(shí)驗(yàn)中各項(xiàng)數(shù)據(jù)均以(x)±s表示，用OnewayANOVA多重比較進(jìn)行F檢驗(yàn)，比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組及各組間差異。采用Hartley豚鼠來考察辣椒堿傳遞體單次及多次給藥后，對(duì)完整及破損皮膚的刺激性。 結(jié)果：(1)辣椒堿提取分離與純化。在測(cè)定的藥材中，河北定州王、四川辣椒王中辣椒堿含量(0.134～0.145％)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他品種(0.013～0.083％)。將河北定州王的籽與皮分開測(cè)定，發(fā)現(xiàn)辣椒皮中(1.23％)辣椒

12、堿是辣椒籽(0.189％)的6.5倍。以河北定州王為原料，經(jīng)提取分離純化所得結(jié)晶，采用UV、TLC、HPLC及熔點(diǎn)確認(rèn)該成分為辣椒堿單體結(jié)構(gòu)。 (2)辣椒堿傳遞體的制備及結(jié)構(gòu)大小、包封率、穩(wěn)定性測(cè)定。薄膜分散法、薄膜-高壓勻質(zhì)法及滴入-高剪切法制各辣椒堿傳遞體，透射電鏡及zetasizer激光光子粒度儀測(cè)定辣椒堿傳遞體粒徑分別為3-5μm，80nmand150nm。滴入-高剪切法、薄膜-高壓勻質(zhì)法均能得到納米級(jí)的傳遞體泡囊，結(jié)構(gòu)

13、為小單室。 (3)釋放速度劑體外皮膚滲透性。釋放度速度表明，在最初的4h，累積釋放量線性增加，4h后釋放比較平緩。傳遞體中辣椒堿累積透皮量顯著高于霜?jiǎng)⒒鞈乙?。傳遞體中膽酸鈉的比例升高，辣椒堿于大鼠腹部皮膚的累積透過率稍有增加。用司盤-80及吐溫-80兩種表面活性劑取代膽酸鈉，累積透過率幾乎沒有改變。比較傳遞體中辣椒堿在小鼠、大鼠及人的體外皮膚透過性，結(jié)果小鼠＞＞大鼠＞＞人。比較傳遞體中辣椒堿在人體腹部完整皮膚、角質(zhì)層、真皮層體

14、外累積透皮量，角質(zhì)層＞＞真皮層、完整皮膚。 (4)局部應(yīng)用辣椒堿傳遞體后辣椒堿體內(nèi)組織分布。大鼠腹部單次注射辣椒堿注射液，辣椒堿血藥濃度顯著高于其它組織，注射后1h達(dá)到峰值，4h基本降至零。局部單次給藥，辣椒堿在大腿皮膚的濃度顯著高于其它組織，這與局部給以辣椒堿傳遞體，藥物需要從泡囊釋放并要穿透皮膚而具有滯后作用有關(guān)。單次給藥，無論是注射還是局部給藥，辣椒堿在肌肉及骨頭的濃度均較低，這與單劑量藥效學(xué)效果較差相一致。連續(xù)5天多劑量

15、給藥，與單次給藥相比，辣椒堿在各組織中均達(dá)到了穩(wěn)態(tài)，濃度平穩(wěn)且具有較高水平。 (5)辣椒堿傳遞體局部應(yīng)用藥效學(xué)及毒理學(xué)評(píng)價(jià)。單劑量注射給藥，高劑量(2.5mg/kg)能明顯延長(zhǎng)小鼠舔后足時(shí)間及減少扭體次數(shù)(p＜0.05)，顯示較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛效果。與注射給藥45min分鐘發(fā)揮藥效不同，單劑量口服給藥60分鐘才起效，而單劑量皮膚局部給藥，鎮(zhèn)痛效果不理想(P＞0.05)。多劑量局部應(yīng)用辣椒堿傳遞體，不僅能顯著抑制二甲苯所致耳廓腫脹，顯示較

16、強(qiáng)的抗炎活性，而且明顯延長(zhǎng)小鼠舔后足時(shí)間及減少冰醋酸刺激引起的扭體次數(shù)(p＜0.05)，鎮(zhèn)痛效果明顯且呈現(xiàn)劑量依賴性。無論單次還是多次給藥，辣椒堿傳遞體對(duì)正常及損傷皮膚均無刺激性。相反，辣椒顛茄貼膏在相同條件下對(duì)皮膚有一定的刺激性。 結(jié)論：辣椒藥材乙醇回流提取液經(jīng)酸堿-有機(jī)溶劑萃取及硅膠G柱層析分離得到辣椒堿并采用UV、TL℃、HPL℃及熔點(diǎn)確認(rèn)了辣椒堿單體結(jié)構(gòu)，關(guān)于辣椒堿單體結(jié)構(gòu)的分離及確認(rèn)本文屬首次報(bào)道。 傳遞體體中

17、辣椒堿外累積透皮量顯著高于霜?jiǎng)?、混懸液，說明傳遞體確有增加藥物透皮作用。辣椒堿小鼠腹部皮膚累積透皮量顯著高于大鼠及人體皮膚，而大鼠的累積透皮量也顯著高于人體，因此，小鼠及大鼠是否適合作為透皮制劑透皮研究的動(dòng)物值得思考。而在人體，角質(zhì)層的累積透皮量顯著高于真皮層及完整皮膚，不同于一般的推測(cè)，認(rèn)為角質(zhì)層是透皮吸收的主要障礙的說法，這與離體皮膚與活體動(dòng)物皮膚狀態(tài)不一樣有關(guān)。 單次給藥局部給藥，辣椒堿在大腿皮膚的濃度顯著高于其它組織，注

18、射給藥，血液中濃度最高。無論是注射還是局部給藥，辣椒堿在肌肉及骨胳的濃度均較低，說明單次給藥，難以達(dá)到理想治療濃度。多劑量給藥，辣椒堿在各組織中均達(dá)到了穩(wěn)態(tài)，濃度平穩(wěn)且高于單次給藥。 單劑量局部應(yīng)用辣椒堿傳遞體，鎮(zhèn)痛效果不理想，與前面單次給藥辣椒堿在相關(guān)組織濃度較低的結(jié)果相吻合。多劑量抗炎、鎮(zhèn)痛作用較強(qiáng)，證實(shí)了辣椒堿傳遞體的有效性。辣椒堿傳遞體單次及多次給藥對(duì)完整及破損皮膚均無刺激。 研究結(jié)果表明，辣椒堿傳遞體達(dá)到了增強(qiáng)