NF-κBp65，I-κBα及iNOS在豚鼠椎基底動脈缺血再灌注耳蝸損傷中的作用和葛根素的保護作用研究.pdf

1、第一部分椎基底動脈缺血/再灌注對豚鼠聽功能和耳蝸形態(tài)學影響。 目的:建立豚鼠椎基底動脈缺血/再灌注耳蝸損傷模型，探討椎基底動脈缺血/再灌注耳蝸損傷后耳蝸病理形態(tài)學和聽功能改變。 方法:經顱底徑路建立豚鼠椎基底動脈缺血/再灌注耳蝸損傷模型。顯露基底動脈，用無創(chuàng)傷微動脈夾阻斷基底動脈，缺血1小時后松開微動脈夾恢復血流行再灌注。68只豚鼠隨機分成6組：正常組、缺血1小時組、缺血再灌注組(按再灌注時間分12h、24h、48h、7

2、d四組)。各組動物分別于手術前和處死前行聽性腦干反應(auditorybrainstem response,ABR)測定，觀察ABR各波潛伏期、Ⅰ-Ⅲ波間期和Ⅲ波閾值，部分動物觀察了缺血時ABR變化。應用耳蝸基底膜鋪片和耳蝸組織切片HE染色技術觀察組織細胞形態(tài)變化。 結果: 1.聽功能檢測：血管阻斷缺血時ABR表現(xiàn)波形不典型，重復性差，在缺血10～20min后波形逐漸穩(wěn)定；缺血組與再灌注(12h、24h、48h、7d)各

3、組ABR各波潛伏期和Ⅰ-Ⅲ波間期較正常組延長，Ⅲ波閾值升高，尤以再灌注24h變化最為顯著，48h和7d后ABR閾值有所恢復，但不能恢復正常。 2.耳蝸病理形態(tài)學改變：缺血組毛細胞變形腫脹，再灌注(12h、24h、48h、7d)各組損傷進一步加重，再灌注24～48小時損傷最重，可見明顯外毛細胞缺損，螺旋神經元胞體和神經纖維較正常組減少，血管紋變薄，均以基底轉為明顯。 結論:豚鼠椎基底動脈缺血/再灌注時可致耳蝸損傷，表現(xiàn)為聽

4、功能和耳蝸組織形態(tài)學改變。 第二部分 NF-κBp65、Ⅰ-κBα及iNOS在豚鼠椎基底動脈缺血/再灌注耳蝸損傷中的作用。 目的:探討豚鼠椎基底動脈缺血/再灌注時NF-κB p65/I-κBa-iNOS通路在耳蝸再灌注損傷中的分子作用機制。了解 NF-κBp65、IκBα、iNOS 蛋白質在耳蝸缺血再灌注損傷過程中的空間分布特點和表達時間規(guī)律；確定是否存在NF-κBp65的激活和核轉位及有無IκBα的降解，為耳蝸缺血再灌

5、注損傷的藥物防治提供理論依據。 方法:采用石蠟包埋的免疫組織化學技術，對各組近中軸位切片行 NF-κBp65(nuclear factor kappa Bp65)、IκBa(inhibitory kappa B)、iNOS(inducible nitric oxide synthase)免疫組織化學染色，光學顯微鏡下觀察耳蝸組織內的表達情況，并通過圖像分析系統(tǒng)進行半定量處理分析；提取缺血再灌注側耳蝸組織的細胞核和細胞漿蛋白，采用

6、western blot技術分別研究了正常組、缺血再灌注12h、24h、48h組細胞核和細胞漿內NF-κBp65蛋白水平以及細胞漿內hd3α蛋白水平；應用電泳遷移率滯后分析(Electrophoretic mobility shiR assay,EMSA)檢測細胞核內NF-κB DNA 結合活性；電泳結果成像并行電泳條帶光密度測定進行半定量統(tǒng)計分析。 結果: 1.正常組豚鼠耳蝸螺旋神經節(jié)、Corti’s器、血管紋、螺旋韌

7、帶的細胞漿和/或細胞核內NF-κBp65染色呈陰性，缺血組耳蝸各轉耳蝸螺旋神經節(jié)、Corti’s器內、外毛細胞、血管紋、螺旋韌帶有弱陽性表達，以血管紋、螺旋韌帶、螺旋神經節(jié)表達較強，主要見細胞漿著色。缺血再灌注各組在上述部位表達逐漸增強，在再灌注12h可見明顯表達，24h表達最強，以后表達逐漸減弱，尤在底轉表達明顯，著色部位主要在胞核，尤其是在再灌注24h胞核著色最為明顯。正常組與缺血組及缺血再灌注各組比較灰度值有統(tǒng)計學差異(P<0.0

8、1)。缺血組與缺血再灌注各組比較灰度值有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。 2.對照組耳蝸螺旋韌帶、螺旋神經節(jié)、血管紋和Corti’s器的細胞漿內可見IκBα陽性表達。著色部位主要在胞漿。缺血再灌注后各組上述部位表達減弱。在再灌注12h表達可見較明顯減弱，再灌注24h最弱，48h及7天的表達有所增強。在再灌注48h及7天組可見胞核內亦有表達。正常組與缺血組及缺血再灌注各組比較灰度值有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。缺血組與缺血再灌注各組比

9、較灰度值有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。 3.正常組iNOS在耳蝸各轉螺旋神經節(jié)、血管紋、Corti器內外毛細胞未見明顯陽性表達，缺血組和再灌注各組的iNOS表達逐漸增強，再灌注24h組表達最強。著色部位為細胞漿。正常組與缺血組及缺血再灌注各組比較灰度值有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。缺血組與缺血再灌注各組比較灰度值有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。 4.Western Blot檢測結果顯示：在正常對照組，NF-κBp65亞基主

10、要存在于胞漿內，胞核表達低；在缺血再灌注組耳蝸組織胞漿內NF-κBp65蛋白明顯下降，而胞核內NF-κBp65蛋白則明顯上調。再灌注12h耳蝸組織胞漿內NF-κBp65蛋白開始下降，24h達最低，48h后又有所上升，而胞核內NF-κBp65蛋白的變化則與此相反。在缺血再灌注模型組的耳蝸組織胞漿IkBα水平下降，24h降至最低，48h時IkBα水平有所上升。 5.正常對照組耳蝸組織中可見少量的NF-κB活化；在缺血再灌注組的耳蝸組

11、織中NF-κBDNA的結合活性顯著上調。再灌注24h的結合活性最高。再灌注48h后NF-κBDNA的結合活性下降，但仍然高于正常組。正常對照組與缺血再灌注各組比較積分光密度值有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。 結論: 1、耳蝸缺血再灌注損傷時，NF-κB和iNOS在耳蝸出現(xiàn)異常表達，IkBα表達下調，NF-κB的活化、IkBα的降解和iNOS表達增強在耳蝸缺血再灌注損傷中可能起了一定作用。 2、利用western b

12、lot檢測細胞漿及細胞核內NF-κB蛋白水平和細胞漿內IkBα蛋白水平，證實耳蝸缺血再灌注損傷時NF-κB激活時存在NF-κBp65亞基的核轉位及IkBα的降解。 3、電泳遷移率滯后分析(EMSA)證實在耳蝸缺血再灌注損傷過程中NF-κBDNA結合活性增高。 第三部分葛根素對耳蝸缺血再灌注損傷時聽功能和NF-κBp65、，I-κBα、iNOS的影響。 目的：探討葛根素在豚鼠椎基底動脈缺血/再灌注耳蝸損傷中的保護作

13、用及分子機制，為葛根素治療耳蝸缺血再灌注損傷提供理論依據。 方法:純白雄性豚鼠32只隨機分為4組，每組8只：正常對照組、缺血再灌注7d組、生理鹽水組，即缺血再灌注7d加生理鹽水對照組和用藥組，即缺血再灌注7d加葛根素保護組。除正常對照組外的所有豚鼠均進行手術造模。用藥組在缺血再灌注開始時，腹腔注射葛根素150mg/kg/d，每日一次，連用6天，于再灌注7天時處死。生理鹽水組操作同用藥組，但以等容量生理鹽水代替葛根素。應用聽性腦干

14、反應和耳蝸組織切片HE染色法分別評價聽功能和組織病理學的變化。采用石蠟包埋的免疫組織化學技術，對各組近中軸位切片行NF-κBp65、IκBα、iNOS免疫組織化學染色，以觀察葛根素對NF-κBp65、IκBα、iNOS的影響。 結果:用藥組ABR各波潛伏期和Ⅰ～Ⅲ波間期明顯縮短，閾值降低。正常對照組、缺血再灌注7 d組、用藥組與生理鹽水對照組ABR各波潛伏期、Ⅰ～Ⅲ波間期和閾值比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。正常對照組與用藥組