BMP2介導的成骨通路在顱咽管瘤鈣化中的機制研究及顱咽管瘤雞胚絨毛尿囊膜移植瘤模型的建立.pdf

1、背景：
　　 顱咽管瘤是一種沿顱咽管生長的上皮源性腫瘤，是顱內最常見的先天性腫瘤之一，約占顱內腫瘤的4.7％-6.5％。在兒童中所有顱內腫瘤中其發(fā)病率約為6％-13％，在兒童鞍區(qū)腫瘤中的比例超過60％。1904年奧地利科學家Erdheim首次將顱咽管瘤與胚胎“垂體-咽導管”聯(lián)系起來，并將其作為一類單獨的鞍區(qū)腫瘤進行了描述。早期顱咽管瘤的命名經(jīng)歷過“Rathke's囊腫瘤”，垂體管腫瘤，顱咽導管腫瘤，釉質細胞瘤等名稱。1931年F

2、razier和Alpers首先使用了顱咽管瘤這一名稱，1932年Cushing在其出版的《顱腦腫瘤》一書中，以“顱咽管瘤”為名稱對其進行了較為詳細的描述，統(tǒng)一了這個腫瘤的命名，并一直沿用至今。一百多年來國內外學者針對顱咽管瘤的起源，發(fā)生等領域進行了大量廣泛而深入的研究，但受限于研究模型及研究技術等限制，對腫瘤的病理學特征，腫瘤生物學特性等方面的認識仍存在較大的爭議。
　　 顱咽管瘤屬于WHO-Ⅰ級的良性腫瘤，組織學上，顱咽管瘤可

3、分為:造釉細胞型顱咽管瘤（adamantinomatous craniopharyngioma ACP）和鱗狀乳頭型顱咽管（squamous papillary craniopharyngioma SPCP）兩種亞型，前者好發(fā)于兒童患者，多有鈣化、炎癥，囊性變等表現(xiàn)，后者以成人多見，實性腫瘤較多。顱咽管瘤生長方式多樣，腫瘤所在的鞍區(qū)存在包括垂體柄，視神經(jīng)，視交叉，下丘腦等在內的多個重要結構，手術治療中如果要對顱咽管瘤進行全切除，則容易損

4、傷周圍重要組織，造成相應并發(fā)癥，嚴重者甚至引起死亡。而若僅對腫瘤行部分切除，則復發(fā)率極高。因此較好的切除顱咽管瘤并盡量不損傷其周圍重要結構一直是神經(jīng)外科醫(yī)生面臨的重要難題。
　　 在顱咽管瘤治療的諸多危險因素當中，鈣化是其中較為重要的一個。顱咽管瘤鈣化率高，成人鈣化率約60％，在兒童中鈣化率超過85％。大量臨床資料表明，顱咽管瘤的鈣化灶常與垂體柄、視交叉、頸內動脈，三腦室底等結構聯(lián)系緊密，手術中對其完整剝離存在較大困難。顱咽管瘤

5、的鈣化灶以羥基磷灰石結合多種纖維構成，大塊狀鈣化灶質地多堅韌，術中難以分割切除，整體取出則容易造成對周圍結構的損傷，引起嚴重后果。
　　 臨床病理資料顯示:發(fā)生鈣化的顱咽管瘤多為造釉細胞型，而鱗狀乳頭型則基本不發(fā)生鈣化。組織學上，造釉細胞型顱咽管瘤與牙源性上皮腫瘤及組織存在較大的相似性。牙源性組織所特有的釉質蛋白在造釉細胞型顱咽管瘤中也有表達，而在鱗狀乳頭顱咽管瘤中則沒有發(fā)現(xiàn)。結合“垂體管”發(fā)育過程中的分化路徑，有學者認為雖然在

6、來源上，造釉細胞型顱咽管瘤和鱗狀乳頭型顱咽管瘤均來自于胚胎“垂體-口咽管”的殘余組織，但其起源位置并不相同，前者起源于口凹牙源性組織，而后者起源于頰粘膜組織。
　　 我們的前期研究發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白(osteopontin OPN)在造釉細胞型顱咽管瘤尤其是鈣化嚴重的顱咽管瘤中出現(xiàn)高表達，而在鱗狀乳頭型顱咽管瘤中表達較低。骨橋蛋白是一種細胞分泌型蛋白，由于其自身結構特點，骨橋蛋白對鈣鹽具有較強的親和力。因此，在骨質及牙齒形成的過程中，

7、骨橋蛋白是細胞與礦物質，細胞與細胞，礦物質與礦物質之間結合的“橋梁”蛋白。骨質中的成骨細胞，破骨細胞等均能合成骨橋蛋白，其在骨質合成，分解等代謝過程中均扮演了重要的角色。
　　 骨形成蛋白（bonemorphogeneticprotein BMP）是一種具有成骨誘導能力的生長因子，屬于轉化生長因子-β（transforminggrowthfactor-β TGF-β）超家族成員之一。除能誘導骨質形成之外，BMPs參與了細胞的增殖

8、，分化及侵襲等生理過程。作為一種從骨質中提取的生長因子，BMPs能誘導新生骨的發(fā)生。目前臨床上將其作為促進骨折愈合材料的應用已有十多年。BMPs促進骨質形成主要與其聚集，誘導骨髓間充質細胞分化為成骨表型有關。間充質細胞經(jīng)BMP誘導之后，分化為成骨細胞進而分泌出骨質形成中所必須的各種蛋白如骨鈣素(osteocalcinOCN)，骨橋蛋白，膠原，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase ALP)等，進而促進了鈣鹽的沉積和骨質的形

9、成。
　　 BMP對于牙齒的形成也具有重要作用，其具有誘導牙齒造釉細胞，成牙本質細胞分化的作用。Kumamoto等通過免疫組化，發(fā)現(xiàn)了BMP2，4，7及其受體在牙源性造釉細胞瘤及牙胚組織中的表達，并認為這些蛋白及受體在牙源性組織及腫瘤的分化中具有重要的作用。在一些病理條件下如腫瘤鈣化，血管平滑肌鈣化等方面，BMP的同樣作用同樣突出。其能誘導平滑肌細胞，成纖維細胞分化為成骨表型，并促進鈣鹽在這些位置的沉積，產(chǎn)生異位鈣化/骨化。

10、r>　　 基于BMP在牙源性組織中的表達以及骨橋蛋白在顱咽管瘤鈣化中的重要作用，我們以BMPs家族中主要因子之一BMP2作為切入點，結合BMP2所介導的通路中具有成骨分化標記作用的轉錄因子RUNX2及OSTERIX作為研究對象，回顧性地分析這三個成骨因子在顱咽管瘤中的表達，并結合顱咽管瘤組織學特點與這些因子在腫瘤中的表達部位及分布特點，探討顱咽管瘤鈣化的內在機制。同時，我們利用前期工作中建立的顱咽管瘤原代細胞模型，以人重組的BMP2蛋

11、白刺激腫瘤細胞，檢測BMP2通路中的重要因子RUNX2，OPN，ALP的表達，初步確定BMP2介導的成骨通路在顱咽管瘤中的調控作用，并以茜素紅染色實驗檢測BMP2是否能直接刺激顱咽管瘤直接發(fā)生鈣化。最后，我們利用低免疫生物體雞胚作為載體，探討建立顱咽管瘤雞胚移植瘤實驗模型的可行性，為下一步實驗提供更多可選擇的平臺。
　　 第一章
　　 一、BMP2，RUXN2及OSTERIX在顱咽管瘤中的表達目的檢測BMP2，RUNX2

12、及OSTERIX在顱咽管瘤中的表達，發(fā)現(xiàn)其與顱咽管瘤鈣化的關系。
　　 方法：
　　 收集顱咽管瘤術后標本，運用免疫組化及Western-blot方法回顧性的分析顱咽管瘤病理分型及鈣化分級與BMP2，RUNX2及OSTERIX之間的相關關系以及這些蛋白間的相互關系;利用HE染色觀察顱咽管瘤鈣化灶及其他組織學結構的特點，結合三個成骨因子在顱咽管瘤中的表達位置及分布特點，分析成骨因子的表達模式與顱咽管瘤鈣化灶形成之間的關系。

13、
　　 結果：
　　 HE染色顯示:在造釉細胞型顱咽管瘤中，常可在同一標本中觀察到鈣化相關上皮結構渦旋狀細胞，“濕性”角化與鈣化灶同時存在同一視野之中，鈣化灶“生長”于其所在的“濕性”角化結構。部分顱咽管瘤鈣化標本中可見含骨陷窩的類骨樣組織。鱗狀乳頭型顱咽管瘤中均未發(fā)現(xiàn)鈣化灶。
　　 免疫組化結果顯示:造釉細胞型顱咽管瘤中BMP2，RUNX2及OSTERIX分別在70.1％(54/77)，55.8％(43/77)

14、和50.6％(39/77)的標本中表現(xiàn)出中等強度以上的表達（moderate and strongly positive expression:＞10％陽性細胞）。鱗狀乳頭型顱咽管瘤中未觀察到BMP2，RUNX2及OSTERIX出現(xiàn)中等強度以上的表達。BMP2為漿和/或膜表達，RUNX2和OSTERIX表現(xiàn)為核/漿表達。三個成骨因子在渦旋狀細胞中表達均較強，而在外圍柵欄狀細胞中表達較弱。其中，RUNX2及OSTERIX常表達于渦旋狀細胞

15、及“濕性”角化和鈣化灶區(qū)域周邊細胞。在鱗狀乳頭型顱咽管瘤中未發(fā)現(xiàn)成骨相關因子的表達。BMP2，RUNX2及OSTERIX在造釉細胞型顱咽管瘤中的表達高于鱗狀乳頭型顱咽管瘤(P值均＜0.001)。造釉細胞型顱咽管瘤中BMP2，RUNX2及OSTERIX在不同鈣化級別分組中的表達差異具有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.001），并且它們的表達與鈣化級別呈正相關（P值均＜0.001）。BMP2，RUNX2及OSTERIX在發(fā)生鈣化的造釉細胞型顱咽管瘤

16、中的表達要高于鱗狀乳頭型顱咽管瘤(P值均＜0.001)，而在未發(fā)生鈣化的造釉細胞型顱咽管瘤中的表達與在鱗狀乳頭型顱咽管瘤中的表達差異無統(tǒng)計學意義(BMP2，RUNX2及OSTERIX的P值分別=0.392，0.517，0.212)。BMP2，RUNX2及OSTERIX之間的相關性分析顯示造釉細胞型顱咽管瘤中其兩兩之間均呈正相關關系（P值均＜0.001）。
　　 Western-blot結果顯示:造釉細胞型顱咽管瘤中BMP2，RU

17、NX2及OSTERIX的表達隨著鈣化級別的升高而升高，未鈣化的造釉細胞型顱咽管瘤和鱗狀乳頭型顱咽管瘤中這三種蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義（BMP2，RUNX2及OSTERIX的P值分別=0.551，0.609，0.295）
　　 結論：
　　 BMP2及其所介導的通路中重要的成骨標記性轉錄因子RUNX2和OSTERIX在顱咽管瘤鈣化中扮演了重要的角色，BMP2可能是通過誘導顱咽管瘤發(fā)生成骨分化，最終引起腫瘤中發(fā)生鈣鹽沉積。

18、
　　 第一章
　　 第二節(jié)、人重組BMP2誘導顱咽管瘤細胞發(fā)生成骨樣分化研究
　　 目的：探討外源性人重組BMP2能否誘導顱咽管瘤細胞發(fā)生成骨分化并產(chǎn)生鈣化。
　　 方法：
　　 以外源性人重組BMP2刺激顱咽管瘤細胞，觀察其下游功能蛋白OPN基因的表達變化。確認BMP2對OPN基因的刺激作用之后，進一步以Western-blot檢測在BMP2刺激之后其成骨通路中的重要因子ALP，OPN及RUN

19、X2的表達情況以及當BMP2的刺激作用受到其拮抗劑NOGGIN拮抗時這些因子的表達變化。最后以茜素紅染液對經(jīng)BMP2誘導之后的顱咽管瘤細胞進行染色，觀察與對照組相比其是否會發(fā)生明顯的鈣鹽沉積。
　　 結果：
　　 Q-PCR結果顯示:與空白對照組相比，在50ng/ml濃度下，OPN的含量開始出現(xiàn)略微升高，并在200ng/ml濃度BMP2刺激下出現(xiàn)了顯著升高，四個病人樣本實驗組與自身對照組相比其升高倍數(shù)分別為7.6倍、4.

20、9倍、8.7倍和5倍。
　　 Western-blot結果顯示: OPN及RUNX2在200ng/ml濃度BMP2刺激之后蛋白表達比空白對照組（BMP2組VS.CON組）高（P值均＜0.001.）而ALP在這兩組間的表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.093)，三個蛋白BMP2組的表達量均比BMP2+NOGGIN組低，差異具有統(tǒng)計學意義(ALP，OPN，RUNX2的P值分別為＜0.001,=0.029,＜0.001)。
　　

21、茜素紅染色實驗:經(jīng)過14天的誘導，BMP2組出現(xiàn)了明顯的鈣化灶及鈣鹽沉積，對照組無明顯變化。BMP2+NOGGIN組的鈣化比BMP2組低。
　　 結論：
　　 顱咽管瘤細胞可被外源性人重組BMP2誘導而發(fā)生成骨分化，成為一種類成骨樣細胞并產(chǎn)生鈣鹽沉積;在BMP2刺激下，其下游成骨因子會發(fā)生相應升高，并且這種作用會被NOGGIN所拮抗，顯示BMP2所介導的成骨通路是顱咽管瘤鈣化所依賴的重要途徑。
　　 第二章、顱咽

22、管瘤雞胚絨毛尿囊膜移植瘤模型的建立
　　 目的：初步建立顱咽管瘤雞胚絨毛尿囊膜(Chorioallantoic Membrane CAM)移植瘤模型，并評估移植瘤血管生成能力及細胞增殖能力。
　　 方法：
　　 利用術中所得顱咽管瘤組織，異種移植到雞胚CAM表面，建立移植瘤模型。對移植瘤瘤體周圍CAM血管進行測定，評估移植瘤CAM血管生成能力，同時利用免疫組化法以CD34標記移植瘤微血管密度(Microvesse

23、l Density MVD)，以PCNA檢測移植瘤細胞增殖活性。
　　 結果：
　　 成功建立顱咽管瘤CAM移植瘤模型，造釉細胞型顱咽管瘤成瘤率為47.14％，鱗狀乳頭型顱咽管瘤成瘤率為43.33％，兩者無顯著差異(P=0.726);造釉細胞型移植瘤瘤周CAM血管生成能力，微血管密度及細胞增殖活性均高于鱗狀上皮型移植瘤。移植瘤的PCNA與MVD及CAM血管評分均呈正相關關系(相關系數(shù)及相應P值分別為rs=0.649，P＜