小金海棠缺鐵消減文庫(kù)的構(gòu)建及MxNas1基因的克隆與功能分析.pdf

1、蘋(píng)果是我國(guó)栽培面積最大的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，但缺鐵黃葉病嚴(yán)重地影響了蘋(píng)果的品質(zhì)及其經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。因而研究和克隆缺鐵脅迫相關(guān)基因?qū)檫M(jìn)一步研究蘋(píng)果吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的分子機(jī)理以及基因工程打下基礎(chǔ)。 本試驗(yàn)以鐵高效基因型植物—蘋(píng)果屬小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)為材料，以缺鐵處理(4μM Fe-EDTA)小金海棠根的eDNA為T(mén)ester，以正常供鐵(40μM Fe-EDTA)根的cDNA為Driver，

2、利用抑制性消減雜交(Suppression subtractive hybridization，SSH)的方法，構(gòu)建了包含1152個(gè)克隆的小金海棠消減cDNA文庫(kù)，通過(guò)PCR檢測(cè)插入片段大小大約在300～1000bp之間。 為進(jìn)一步確定陽(yáng)性克隆，對(duì)構(gòu)建的消減cDNA文庫(kù)進(jìn)行差異篩選，得到差異表達(dá)片段(ESTs)105個(gè)。其中50個(gè)EST<,s>與其它物種同源性較高，視為已知基因，并根據(jù)其功能分為9個(gè)組；23個(gè)是與已知EST<,s

3、>重復(fù)的基因片段；另外32個(gè)EST<,s>在GenBank中無(wú)法查到對(duì)應(yīng)的同源序列，可能代表了新基因。 在105個(gè)差異表達(dá)的EST<,s>中，其中有一個(gè)與編碼番茄尼克胭酰胺合成酶基因有63％相似性，被用來(lái)做進(jìn)一步的研究。利用RACE方法克隆得到了該基因的全長(zhǎng)，命名為MxNasl，GenBank登錄號(hào)為DQ403256，該基因全長(zhǎng)1305bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?75bp，編碼325個(gè)氨基酸。 Northern雜交結(jié)果顯示，Mx

4、Nasl，基因在缺鐵和正常供鐵條件下的小金海棠根和葉中均表達(dá)，但是在根中的表達(dá)量要明顯高于葉中的表達(dá)量。缺鐵處理5天后，MxNas，基因在根中的表達(dá)沒(méi)有明顯升高，10天到15天表達(dá)增強(qiáng)。而同樣缺鐵處理的葉片，直到15天表達(dá)仍然沒(méi)有明顯變化。 為了研究．MxNasl，基因的功能，構(gòu)建了小金海棠MxNasl基因正義和反義兩種表達(dá)載體，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化了煙草及番茄突變體(Chloronerva)。獲得的轉(zhuǎn)基因番茄能夠互補(bǔ)

5、突變體的表型，即葉脈及脈間復(fù)綠；對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行不同濃度鐵處理14天后，轉(zhuǎn)正義載體煙草在缺鐵情況下葉片沒(méi)有黃化，表現(xiàn)山了較強(qiáng)的抗缺鐵能力；轉(zhuǎn)反義載體植株比對(duì)照煙草幼葉提前出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，表現(xiàn)了更加不耐缺鐵。另外，轉(zhuǎn)正義載體煙草還出現(xiàn)了早開(kāi)花現(xiàn)象。 對(duì)不同濃度鐵處理14天后的轉(zhuǎn)基因煙草Fe、Mn、Cu、Zn含量的測(cè)定結(jié)果表明：無(wú)論哪種鐵濃度處理，轉(zhuǎn)正義載體煙草葉中Fe、Mn、Cu、Zn的含量比對(duì)照均有所提高，根中則提高不明顯；轉(zhuǎn)反義