TAURINE對骨代謝作用的研究.pdf

1、第一部分 成骨細(xì)胞表達(dá)TAUT，Taurine誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化 第一章 成骨細(xì)胞表達(dá)Taurine轉(zhuǎn)運(yùn)體 目的：Taurine是細(xì)胞內(nèi)含量豐富的一種條件必須氨基酸，有許多重要的生理功能和藥理功能。Taurine主要通過taurine轉(zhuǎn)運(yùn)體(Taurine Transporter，TAUT)攝入細(xì)胞。本研究首次探討taurine轉(zhuǎn)運(yùn)體在成骨細(xì)胞的表達(dá)及其攝取[<'3>H]taurine的功能。 方法：應(yīng)用RT-P

2、CR測定TAUT mRNA在成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄及其在成骨細(xì)胞分化時的表達(dá)變化，利用Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測TAUT蛋白在成骨細(xì)胞的表達(dá)。采用[<'3>H]taurine攝入法評價成骨細(xì)胞TAUT的功能。 結(jié)果：原代培養(yǎng)的人成骨細(xì)胞、人骨肉瘤成骨細(xì)胞系MG63和小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1均表達(dá)TAUT mRNA和蛋白。TAUT mRNA的表達(dá)量隨著人成骨樣MG63細(xì)胞的分化而逐漸升高。在成骨細(xì)胞分化過程中，T

3、AUT的攝取[<'3>]taurine的功能逐漸增強(qiáng)。 結(jié)論：成骨細(xì)胞可轉(zhuǎn)錄及翻譯TAUT，并且TAUT mRNA的表達(dá)和攝取[<'3>H]taurine的功能在成骨細(xì)胞分化過程中逐漸增強(qiáng)。 第二章Taurine通過ERKl／2信號途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞分化 目的：Taurine是一種細(xì)胞內(nèi)含量豐富的自由氨基酸，有著許多重要的生理作用和藥理功能。我們原來的研究發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞有TAUT的表達(dá)，但taurine對成骨細(xì)胞的作

4、用機(jī)制尚未闡明，本研究探討taurine對成骨樣MG63細(xì)胞分化的作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 方法：堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性用α-磷酸奈酚法測定，骨鈣素(osteocalcin，OC)用ELISA法檢測，同時研究taurine對成骨細(xì)胞基質(zhì)礦化功能的影響。p-ERK，ERK，p-p38，p38，p-JNK,JNK用Western Blot檢測，聯(lián)合ERKl／2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑PD98059，p

5、38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑SB203580和JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷SP600125干預(yù)，以探討taurine對成骨細(xì)胞分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 結(jié)果： (1)Taurine增強(qiáng)成骨樣MG63細(xì)胞ALP活性，促進(jìn)OC的分泌和礦化結(jié)節(jié)的形成。 (2)Taurine誘導(dǎo)成骨細(xì)胞ERKI／2磷酸化，而對p38和JNK的激活卻無作用。ERKl／2抑制劑PD98059可阻斷taurine對成骨細(xì)胞的促分化作用，說明ERKl／2在taurine促進(jìn)成骨細(xì)

6、胞分化中起關(guān)鍵作用。 結(jié)論：Taurine通過ERKI／2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)成骨樣MG63細(xì)胞的分化。 第二部分 破骨細(xì)胞表達(dá)TAUT，TauriHe抑制破骨細(xì)胞分化 第一章破骨細(xì)胞表達(dá)Taurine轉(zhuǎn)運(yùn)體 目的：骨組織中含有豐富的taurine，成骨細(xì)胞可表達(dá)TAUT，但破骨細(xì)胞是否表達(dá)TAUT尚未明確。本研究旨在探討TAUT在破骨細(xì)胞的表達(dá)及其攝取[<'3>H]taurine功能。 方法：利用

7、RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞形成破骨細(xì)胞，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR和免疫印跡檢測RANKL誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞TAUT mRNA和蛋白的表達(dá)。用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞和骨巨細(xì)胞瘤破骨細(xì)胞TAUT蛋白的表達(dá)。應(yīng)用[<'3>H]taurine攝取法評價RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞在分化過程中，TAUT功能的變化。 結(jié)果：(1)RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞形成的破骨細(xì)胞，可表達(dá)TAUT mRNA和TA

8、UT蛋白,RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞和取白骨巨細(xì)胞瘤的破骨細(xì)胞TAUT免疫組化檢測均陽性。(2)隨著破骨細(xì)胞的分化進(jìn)程，TAUT的表達(dá)量逐漸增加，并且其攝取[<'3>H]taurine的功能逐漸增強(qiáng)。 結(jié)論：破骨細(xì)胞可表達(dá)功能性的TAUT，隨著破骨細(xì)胞分化TAUT攝取[<'3>H]taurine的功能逐漸增強(qiáng)。 目的：研究taurine對RANKL誘導(dǎo)的破骨前體細(xì)胞RAW264．7形成破骨細(xì)胞的影響，并進(jìn)一步探討tauri

9、ne對破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響。 方法：應(yīng)用MTT法測量taurine和／或RANKL對RAW264．7細(xì)胞活性的影響?？咕剖崴嵝粤姿崦?TRAP)染色法觀察taurine對TRAP陽性多核破骨細(xì)胞形成的影響，用骨吸收陷窩面積計(jì)數(shù)法分析破骨細(xì)胞的骨吸收功能。 結(jié)果：Taurine對RAW264．7細(xì)胞無明顯毒性作用，RANKL明顯抑制RAW264．7細(xì)胞的增殖，但taurine和RANKL之間無協(xié)同作用。taurine

10、可抑制RANKL誘導(dǎo)的TRAP陽性多核破骨細(xì)胞的形成，并抑制其骨吸收功能。 結(jié)論：Taurlne能直接抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成及其骨吸 收功能。 第三部分Taurine通過ERKl／2途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞結(jié)締組織生長因子的表達(dá) 目的：研究taurine對成骨細(xì)胞結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達(dá)的影響，并探討該作用的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 方法：用Real-time PCR檢測taurine對MC3T3

11、-E 1成骨細(xì)胞CTGFmRNA表達(dá)的影響，用Westem blot檢測taurine對成骨細(xì)胞培養(yǎng)上清中CTGF表達(dá)的改變。聯(lián)合ERKl／2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑PD98059干預(yù)，以研究taurine對CTGF作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 結(jié)果：Taurine呈時間和劑量依賴性促進(jìn)成骨細(xì)胞CTGF的表達(dá)。Taurine可誘導(dǎo)MC3T3-E1成骨細(xì)胞ERKl／2的磷酸化，ERKl／2抑制劑可阻斷taurine促進(jìn)成骨細(xì)胞CTGF表達(dá)的作用。