荔枝果肉多酚的分離鑒定及其調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝作用機(jī)制.pdf

1、荔枝(LitchichinensisSonn.)是熱帶亞熱帶地區(qū)重要的代表性水果。我國(guó)荔枝種植面積和產(chǎn)量均居世界第一。由于荔枝采收期集中，且不耐儲(chǔ)藏，精深加工成為推動(dòng)荔枝產(chǎn)業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展的主要出路。作為嶺南地區(qū)的代表性珍稀果品，荔枝自古被認(rèn)為具有一定的滋補(bǔ)功效。探明其健康效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理對(duì)于指引荔枝的精深加工方向有重要意義。雖然已經(jīng)有研究從現(xiàn)代藥理學(xué)角度報(bào)道了荔枝果肉的抗氧化、抗輻射和保護(hù)肝臟等功效，然而上述各項(xiàng)研究尚未涉及

2、其活性物質(zhì)基礎(chǔ)。項(xiàng)目組及國(guó)內(nèi)外同類(lèi)研究結(jié)果表明荔枝果肉富含酚類(lèi)物質(zhì)，具有明顯的抗氧化活性，但對(duì)果肉中各種單體酚類(lèi)物質(zhì)的活性差異還缺乏認(rèn)識(shí)。大量研究表明多種不同來(lái)源的酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)改善機(jī)體血脂代謝有明顯作用。荔枝果肉多酚作為亞熱帶地區(qū)居民重要的膳食多酚來(lái)源對(duì)于脂質(zhì)代謝的影響尚未見(jiàn)研究報(bào)道。為此，本研究在確定荔枝果肉多酚最佳提取條件的基礎(chǔ)上，探討其對(duì)高脂血癥小鼠脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用，通過(guò)分析攝入荔枝果肉多酚對(duì)血脂代謝相關(guān)microRNA及其下游靶

3、基因表達(dá)的影響，探明其調(diào)節(jié)脂代謝分子機(jī)制;進(jìn)而在體外活性跟蹤下鑒定出荔枝果肉主活性單體組分。研究結(jié)果對(duì)促進(jìn)荔枝消費(fèi)、指導(dǎo)荔枝功能食品精深加工、推動(dòng)荔枝產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。
　　1.不同提取方法對(duì)荔枝果肉游離酚和結(jié)合酚及其抗氧化活性的影響:分別用不同極性5種溶劑提取荔枝果肉游離酚，采用酸水解法和堿水解法提取結(jié)合酚，采用氧自由基吸收能力分析(ORAC)法和細(xì)胞抗氧化分析（CAA）法測(cè)定其游離酚和結(jié)合酚的抗氧化活性。結(jié)果表明，荔

4、枝果肉丙酮提取物游離酚含量最高。該方法提取后的果肉殘?jiān)謩e采用酸水解法和堿水解法提取結(jié)合酚發(fā)現(xiàn)前者的提取效率是后者的2倍。不同溶劑提取的荔枝果肉游離酚中丙酮提取物的ORAC抗氧化活性最高。但丙酮與甲醇提取物的CAA抗氧化活性相當(dāng)，高于乙醇和乙酸乙酯提取物，水提物CAA值最低。酸水解法得到的結(jié)合酚ORAC值和CAA值分別是堿法的2.6和1.9倍。上述結(jié)果表明丙酮水溶劑體系適于荔枝果肉游離酚提取，酸水解法較堿水解法適于提取荔枝果肉結(jié)合酚提取

5、。
　　2.荔枝果肉多酚大孔樹(shù)脂分離工藝優(yōu)化:比較11種不同極性大孔樹(shù)脂對(duì)荔枝果肉酚類(lèi)提取物中總酚和總黃酮的靜態(tài)吸附和解吸性能，優(yōu)化其最佳大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附和解吸工藝參數(shù);通過(guò)HPLC方法對(duì)所得組分酚類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)及其含量變化進(jìn)行分析。HPD-826大孔樹(shù)脂分離純化荔枝果肉總酚和總黃酮效果最好，其吸附和解吸工藝參數(shù)為:荔枝果肉酚類(lèi)提取物上樣濃度0.8mg/mL，上樣速度3.0BV/h，95％乙醇溶液作為洗脫劑，洗脫流速3.0BV/h。經(jīng)

6、HPLC分析和鑒定，HPD-826分離純化荔枝果肉酚類(lèi)不會(huì)造成單體酚組成變化和明顯損失;荔枝果肉酚類(lèi)物質(zhì)主要由3，4-二羥基苯甲酸、兒茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、高兒茶酚、阿魏酸和蘆丁等9種單體組成，其中含量最高的依次是高兒茶酚、蘆丁和表兒茶素，三者合計(jì)占到總量的94.37％。
　　3.荔枝果肉多酚對(duì)高脂膳食小鼠的脂質(zhì)代謝調(diào)控作用及其機(jī)制:以C57BL/6J雄性小鼠為研究對(duì)象，動(dòng)物分為對(duì)照組，高脂模型組和荔枝多酚組。荔

7、枝多酚組攝入高脂膳食的同時(shí)通過(guò)灌胃攝入劑量為500mg/kg·d的荔枝果肉多酚大孔樹(shù)脂純化提取物。10w后結(jié)束實(shí)驗(yàn)，酶法分析各組動(dòng)物血清和肝臟中脂代謝相關(guān)指標(biāo)，采用實(shí)時(shí)定量PCR分析荔枝果肉多酚對(duì)高脂膳食小鼠肝臟miR-33、miR-122和miR-370及其靶基因ABCA1、Fas和Cpt1等mRNA水平，并通過(guò)Westernblotting分析ABCA1、Fas和Cpt1a等蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，荔枝多酚組較高脂組小鼠血清總甘油

8、三酯和總膽固醇含量降低，高密度脂蛋白含量增加;攝入荔枝果肉多酚可以明顯減輕高脂膳食誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性;與高脂膳食模型組比較荔枝果肉多酚可降低小鼠肝臟miR-33和miR-122表達(dá)水平，下調(diào)其靶基因Fas的表達(dá)水平，上調(diào)ABCA1和Cpt1a的表達(dá)。提示荔枝果肉多酚通過(guò)調(diào)節(jié)miR-33和miR-122及其下游相關(guān)基因的表達(dá)水平，促進(jìn)肝臟膽固醇外運(yùn)和高密度膽固醇形成，同時(shí)降低脂肪酸合成并加速其氧化利用，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)血脂的作用。
　　

9、4.荔枝果肉多酚的的結(jié)構(gòu)鑒定及其細(xì)胞抗氧化活性:為進(jìn)一步探明荔枝果肉主要活性酚類(lèi)物質(zhì)單體組成，本研究采用聚酰胺樹(shù)脂對(duì)上述經(jīng)HPD-826型大孔樹(shù)脂分離的荔枝多酚提取物進(jìn)行進(jìn)一步純化，并采用CAA和ORAC活性跟蹤評(píng)價(jià)不同級(jí)分抗氧化活性，以分離出其主要抗氧化級(jí)分。對(duì)抗氧化活性高的級(jí)分經(jīng)制備型反相液相色譜純化獲得3個(gè)單體組分，經(jīng)ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR和HMBC譜分別鑒定為槲皮素-3-O-素蕓香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷

10、、蘆丁和表兒茶素。此3種黃酮類(lèi)化合物的含量依次為17.25mg/100gFW、3.58mg/100gFW和2.31mg/100gFW。HPLC鑒定的荔枝果肉中含量最高的高兒茶酚經(jīng)波譜確證為槲皮素-3-O-蕓香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷。其顯示出較好的CAA活性，與廣泛報(bào)道的木屐草素相當(dāng)，較桑色素和二氫楊梅素高。上述結(jié)果表明槲皮素-3-O-蕓香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷是荔枝果肉中含量最高，抗氧化活性最強(qiáng)的單體酚類(lèi)成分。因此，該化合物

11、可能是荔枝果肉發(fā)揮抗氧化及脂代謝調(diào)控等作用的主活性酚類(lèi)單體。
　　本研究的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn):①建立了荔枝荔枝果肉中游離酚和結(jié)合酚的提取分離純化方法，首次從荔枝中分離鑒定出酚類(lèi)物質(zhì)槲皮素-3-O-蕓香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷，并確證其是荔枝果肉多酚抗氧化作用的主活性組分。②發(fā)現(xiàn)并確證荔枝果肉多酚降低高脂血癥小鼠的血脂水平并改善其血脂代謝作用，首次從其調(diào)節(jié)miR-33、miR-122和miR-370及其靶基因ABCA1、Fas、Cpt1