脂質(zhì)對糖尿病視網(wǎng)膜TGF-β2與TβRⅡ表達及內(nèi)皮細胞凋亡的影響.pdf

1、糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy，DR)是患者致盲的主要原因之一，其確切的發(fā)病機制尚不清楚，目前認為是多種因素協(xié)同作用的結(jié)果。在過去的幾十年來對這種高葡萄糖導(dǎo)致的疾病的認識有很大的進展，但脂代謝紊亂在糖尿病微血管病變中的作用機制目前尚不清楚。臨床觀察表明脂代謝紊亂與糖尿病視網(wǎng)膜病變有密切關(guān)系，因此研究其作用機制就顯得尤為重要。 DR的病理改變包括毛細血管閉塞，微動脈瘤形成，血管壁內(nèi)周細胞的選擇性喪失，

2、基底膜的增厚和新生血管形成。在DR中，視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞、Muller細胞、神經(jīng)節(jié)細胞、周細胞通過凋亡而喪失，這種情況在DR的早期就可出現(xiàn)，目前國內(nèi)外還未見有關(guān)脂代謝紊亂與視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞凋亡關(guān)系的相關(guān)報道。 新生血管形成與視網(wǎng)膜缺血關(guān)系密切，生長因子在其病理過程中起重要作用。缺血的視網(wǎng)膜能分泌生長因子，刺激殘存的血管增殖。脂代謝紊亂導(dǎo)致DR的分子機制目前仍不清楚。TGF-β與內(nèi)皮細胞的增殖、黏附和細胞外基質(zhì)的聚積有關(guān)。在哺乳動

3、物中，TGF-β有三種異構(gòu)體，命名為TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。TGF-β在眼組織中有廣泛表達，其中在視網(wǎng)膜組織中主要表達TGF-β2。TGF-β作為一種具有雙相功能的生長調(diào)節(jié)子，其刺激或抑制增殖的作用依賴細胞的培養(yǎng)條件、TGF-β的濃度及其他防同調(diào)節(jié)的細胞因子。TGF-β通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的增殖、移行，促進血管腔的形成和成熟而參與新生血管形成。 TGF-β通過與靶細胞表面的特異受體結(jié)合而發(fā)揮生物效應(yīng)。細胞有表面的

4、二種TGF-β受體(TβR I、TβR II)，這二種受體的跨膜絲氨酸/蘇氨酸部分通過形成受體復(fù)合物參與TGF-β的信號通路，從而調(diào)節(jié)TGF-β的效應(yīng)，II型受體的激酶活性是信號傳導(dǎo)所必需的。目前還未見有關(guān)脂代謝紊亂對視網(wǎng)膜TGF-β2及其II型受體影響的相關(guān)報道。 基于上述原因，本研究探討脂毒性對視網(wǎng)膜TGF-β2、TβR II表達及內(nèi)皮細胞凋亡的影響。 第一章：高脂喂養(yǎng)對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜TGF-β2與TpR II m

5、RNA表達的影響 目的：探討高脂喂養(yǎng)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中TGF-β2及TpR IImRNA的表達。 方法：應(yīng)用RT-PCR方法檢測高脂喂養(yǎng)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中TGF-β2及TpRII mRNA的表達水平。 結(jié)果：糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中TGF-β2 mRNA的表達高于非糖尿病大鼠視網(wǎng)膜(P<0.01)；高脂喂養(yǎng)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中TGF-β2 mRNA的表達高于普通喂養(yǎng)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜(P<0.01)；TpR II

6、mRNA的表達水平在非糖尿病大鼠視網(wǎng)膜與糖尿病大鼠視網(wǎng)膜間比較無明顯差異；高脂喂養(yǎng)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中TβR II mRNA的表達水平與普通喂養(yǎng)的糖尿病大鼠間比較亦無明顯差異。 結(jié)論：高脂喂養(yǎng)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中TGF-β2 mRNA的表達水平升高。高脂喂養(yǎng)對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中TβRII MRNA的表達無影響。 第二章溶血卵磷脂對牛視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響 目的：探討溶血卵磷脂(LPC)對牛視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮

7、細胞(BRECs)凋亡的影響。 方法：視網(wǎng)膜微血管消化分離后，采用含20％胎牛血清、5％PPP和20μl/ml視網(wǎng)膜浸出液的DMEM培養(yǎng)基，結(jié)合原代細胞的分離、除雜培養(yǎng)BRECs。培養(yǎng)的BRECs中加入不同濃度的LPC(0～60umol/L)，分別培養(yǎng)6小時、12小時、24小時，通過吖啶橙染色在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡，流式細胞檢測細胞凋亡率，F(xiàn)2000熒光分光光度計測細胞內(nèi)鈣離子濃度并計算游離鈣濃度。 結(jié)果：(1)含2

8、0％FBS的DMEM培養(yǎng)基中加入5％PPP及20μl/ml的視網(wǎng)膜浸出液，結(jié)合原代細胞克隆的分離、除雜，可獲得較純凈的BRECs；(2)LPC濃度為60 umol/L作用BRECs24小時后，BRECs凋亡率明顯高于LPC濃度為20umol/L及40umol/L時；LPC濃度從20umol/L增加到60umol/L過程中，細胞內(nèi)游離鈣離子濃度明顯增加，而且細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的增加與LPC的作用時間有關(guān)，作用時間越長，鈣離子濃度越高。

9、 結(jié)論：(1)通過選擇性培養(yǎng)能獲得高純度的BRECs，并能連續(xù)傳代；(2)LPC能增加細胞內(nèi)游離鈣離子濃度，促使BREC的凋亡，而且LPC的這種作用具有時間和劑量依賴性。 第三章：LPC對牛視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞TGF-β2與TβR II mRNA表達的影響 目的：探討不同濃度的LPC對牛視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞TGF-β2與TβR II mRNA表達的影響。 方法：原代分離、培養(yǎng)牛的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞，加入不

10、同濃度的LPC(0～60umol/L)，分別培養(yǎng)6小時、12小時、24小時，RT-PCR檢測TGF-β2 mRNA表達水平，半巢式RT-PCR檢測TβR II mRNA的表達水平。 結(jié)果：RT-PCR結(jié)果表明，LPC濃度為40umol/L作用12小時后，TGF-β2 mRNA水平明顯高于LPC濃度為20 umol/L和60umol/L；LPC濃度改變對TβR II mRNA的表達無明顯影響。 結(jié)論：LPC能調(diào)節(jié)牛視網(wǎng)膜內(nèi)