miR-320a靶向調(diào)節(jié)MMP9抑制血管緊張素Ⅱ誘導的人主動脈血管平滑肌細胞功能及機制研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　第一部分、TAD差異miRNAs在人主動脈血管平滑肌細胞中的表達驗證
　　目的:檢測芯片差異miRNAs在HAVSMC中的表達含量。
　　方法:
　?、購囊阎刂鲃用}夾層與正常主動脈中膜芯片分析結(jié)果中挑選出差異表達的38個miRNAs。
　　②設(shè)計38對miRNA引物。
　?、廴酥鲃用}血管平滑肌細胞傳代培養(yǎng);
　　④提取總RNA，進行RT-PCR檢測，分析結(jié)果。
　

2、　結(jié)果:38個miRNAs在HAVSMC中均有表達，其中12個呈高表達，8個呈中度表達，18個呈低表達。
　　結(jié)論:HAVSMC不同miRNA的表達水平存在差異。
　　第二部分功能性miRNAs高內(nèi)涵篩選
　　目的:篩選出對HAVSMC具有明確功能的miRNAs。
　　方法:
　?、俾《?腺病毒轉(zhuǎn)染HAVSMC預實驗，確定病毒載體。
　　②從上述表達驗證的38個miRNAs中挑選出20個miRNA。

3、
　?、勖鞔_miRNA模擬表達趨勢（上調(diào)/下調(diào)），構(gòu)建相應(yīng)的腺病毒載體，轉(zhuǎn)染HAVSMC。
　?、芑贑ellomics高通量篩選系統(tǒng)，實時細胞計數(shù)，檢測細胞增殖。
　　結(jié)果:
　?、傧俨《緦AVSMC更敏感;
　?、诟鲗嶒灲M，連續(xù)5天，記錄細胞數(shù)，細胞生長狀態(tài)良好，組間細胞增殖存在差異。
　　結(jié)論:篩選出的14/20個miRNA對HAVSMC增殖功能有影響;HCS應(yīng)用于miRNA的批量篩選，準確、

4、穩(wěn)定、可信度高。
　　第三部分、miR-320a靶向調(diào)節(jié)MMP9抑制血管緊張素Ⅱ誘導的人主動脈血管平滑肌細胞增殖遷移功能
　　目的:探討miR-320a對血管緊張素Ⅱ誘導的人主動脈血管平滑肌細胞(HAVSMC)增殖遷移功能的影響及潛在的機制。
　　方法:建立HAVSMC培養(yǎng)體系，
　?、賀T-PCR檢測miR-320a mimics轉(zhuǎn)染人主動脈血管平滑肌細胞的效率;
　?、贑CK-8細胞增殖法，檢測血管緊張

5、素Ⅱ?qū)θ酥鲃用}血管平滑肌細胞作用的時間、濃度曲線以及miR-320a對AngⅡ誘導的HAVSMC增殖作用的影響;
　?、奂毎麆澓?、transwell驗證miR-320a對AngⅡ誘導的HAVSMC遷移功能的影響;
　?、躌T-PCR檢測miR-320a作用于HAVSMC后的MMP9的mRNA表達水平變化;
　?、軼estern Blot檢測人主動脈血管平滑肌細胞MMP-9蛋白水平變化以及MAPK/ERK通路蛋白的表達變