聯(lián)合表達(dá)成熟胰島素與葡萄糖激酶的HepG2細(xì)胞構(gòu)建研究.pdf

1、研究目的： 糖尿病以胰島素絕對(duì)或相對(duì)缺乏而引致各種代謝紊亂為主要特征，其病因尚未完全闡明。傳統(tǒng)治療手段為外源性胰島素替代治療，由于與胰島素分泌的生理模式不符，易致血糖波動(dòng)和劑量不當(dāng)而引起的相關(guān)并發(fā)癥。細(xì)胞移植治療是近年研究的熱點(diǎn)，但由于胰島B細(xì)胞分離與儲(chǔ)存技術(shù)難度較大、代價(jià)昂貴，因此尋找新的移植細(xì)胞來源是該方法亟待解決的關(guān)鍵難題。本課題運(yùn)用基因重組及轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將HepG2細(xì)胞成功改建為具有葡萄糖刺激的胰島素分泌能力(gluco

2、se-stimulatedinsulinsecretion，GSIS)的“胰島代理細(xì)胞”(artificialbetacell)，從而為該難題的解決找到一條新的途徑。 本課題應(yīng)用基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將GK基因與mhPINS基因共轉(zhuǎn)染HepG；細(xì)胞，并獲得穩(wěn)定表達(dá)。該細(xì)胞系一方面可表達(dá)與分泌成熟胰島素，另一方面通過GK使該細(xì)胞的胰島素分泌在一定程度上受葡萄糖濃度調(diào)控，故有望成為糖尿病細(xì)胞移植治療中較理想的移植細(xì)胞來

3、源。 第一部分mhPINS基因逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)體系的建立及在 HepG2細(xì)胞中的表達(dá) 目的：建立mhPINS基因逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)體系，于HepG2細(xì)胞中表達(dá)，并進(jìn)行葡萄糖刺激的胰島素分泌檢測(cè)，從而驗(yàn)證人胰島素原基因定點(diǎn)突變與修飾的效果，了解HepG2／mhPINS細(xì)胞的胰島素分泌是否受葡萄糖濃度調(diào)控，掌握逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)基因表達(dá)的規(guī)律，同時(shí)獲取高滴度的穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞克隆PA317／mhPINS備用。 方法：(

4、1)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pL-mhPINS—SN經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine2~~~介導(dǎo)，轉(zhuǎn)包裝細(xì)胞PA317，經(jīng)G418選擇培養(yǎng)基篩選，NIH3T3細(xì)胞測(cè)定病毒滴度，制備高滴度的穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞克隆PA317／mhPINS備用，并分別以PCR、RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)PA317／mhPINS細(xì)胞中mhPINS基因的整合、轉(zhuǎn)錄及表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)；(2)以PA317／mhPINS病毒感染HepG2細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，所獲抗性細(xì)胞

5、克隆命名為HepG2／mhPINS，分別以PCR、RT-PCR、Western-blot、RIA對(duì)該細(xì)胞及培養(yǎng)上清中mhPINS基因的整合、轉(zhuǎn)錄及表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)；(3)對(duì)HepG2／mhPINS細(xì)胞進(jìn)行葡萄糖刺激的胰島素分泌檢測(cè)；(4)HepG2／mhPINS細(xì)胞培養(yǎng)2月后，以FCM對(duì)mhPINS基因的穩(wěn)定表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果：(1)所獲PA317／mhPINS產(chǎn)毒細(xì)胞克隆，其病毒滴度可達(dá)10'CFU／mL；PA317／m

6、hPINS細(xì)胞的PCR與RT-PCR均獲得286bp的目的條帶，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示PA317／mhPINS細(xì)胞胞漿內(nèi)有棕黃色胰島素顆粒，而PA317／pLXSN細(xì)胞的上述各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均為陰性，證實(shí)在PA317／mhPINS細(xì)胞中已有mhPINS基因的整合、轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。(2)所獲HepG2／mhPINS細(xì)胞克隆生長(zhǎng)良好，PCR與RT-PCR均獲得286bp的目的條帶；Western-blot檢測(cè)可見34kDa的特異性條帶；RIA在其培養(yǎng)

7、上清中檢測(cè)到胰島素與C肽；而HepG2/pLXSN細(xì)胞的上述各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均為陰性，證實(shí)在HepG2／mhPINS細(xì)胞中已有mhPINS基因的整合、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)以及成熟胰島素的分泌。(3)葡萄糖刺激的胰島素分泌檢測(cè)顯示，HepG2／mhPINS細(xì)胞的胰島素分泌對(duì)葡萄糖刺激缺乏反應(yīng)。(4)HepG2／mhPINS細(xì)胞培養(yǎng)2月后，經(jīng)FCM檢測(cè)仍有高達(dá)67．58％的細(xì)胞表達(dá)胰島素，證實(shí)在HepG2／mhPINS細(xì)胞中已獲得mhPINS基因的穩(wěn)定表

8、達(dá)。 結(jié)論：(1)我們對(duì)人胰島素原基因進(jìn)行的定點(diǎn)突變與修飾是成功的，以mhPINS基因轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，可獲得成熟胰島素的分泌；(2)但該細(xì)胞的胰島素分泌并不受葡萄糖濃度的調(diào)控；(3)通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，可獲得目的基因在靶細(xì)胞中的長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)；(4)成功構(gòu)建了高滴度的穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞克隆PA317／mhPINS，為GK基因與mhPINS基因共轉(zhuǎn)染奠定了基礎(chǔ)。 第二部分GK基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)

9、 目的：構(gòu)建GK基因真核表達(dá)載體pcDNA3．1一GKZl并于COS-7細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，驗(yàn)證所獲質(zhì)粒pCMV4-GKZl的序列準(zhǔn)確性，掌握其在真核細(xì)胞中表達(dá)的規(guī)律，為GK基因與mhPINS基因共轉(zhuǎn)染奠定基石出。 方法：(1)獲贈(zèng)質(zhì)粒pCMV4-GKZl以EcoRI、BamHI雙酶切，獲得GKZlcDNA，與同樣酶切的pcDNA3．1載體在T4DNA連接酶作用下連接，構(gòu)建成重組載體pcDNA3．1一GKZl，經(jīng)酶切與測(cè)序鑒

10、定。(2)Lipofectamine2~~~介導(dǎo)pcDNA3．1一GKZl轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，分別以RT-PCR、Western-blot及免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)COS-7／GKZl細(xì)胞中GKZl基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果：(1)構(gòu)建的pcDNA3．1一GKZl重組載體經(jīng)EcoRI、BamHI雙酶切有5．4kb的載體片段及1450bp的GKZlcDNA，GKZlcDNA序列經(jīng)測(cè)序證實(shí)。(2)COS-7／GKZl細(xì)胞RT-P

11、CR擴(kuò)增出498bp的目的片段；Western-blot可見54kDa的特異性條帶；免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示COS-7／GKZl細(xì)胞胞漿中有GK陽性染色；而COS-7/pcDNA3．1細(xì)胞上述各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均為陰性，證實(shí)在COS一7／GKZl細(xì)胞中已獲得GKZl基因的轉(zhuǎn)錄與瞬時(shí)表達(dá)。 結(jié)論：所獲GKZlcDNA序列準(zhǔn)確，可于真核細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。 第三部分聯(lián)合表達(dá)成熟胰島素與GK的HepG2細(xì)胞構(gòu)建 目的：應(yīng)用基因

12、共轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建聯(lián)合表達(dá)成熟胰島素與GK的HepG2細(xì)胞，并進(jìn)行葡萄糖刺激的胰島素分泌檢測(cè)，驗(yàn)證該細(xì)胞內(nèi)是否獲得了葡萄糖刺激的胰島素分泌，為進(jìn)一步的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 方法：(1)建立GKZl基因逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)體系，制備高滴度的穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞克隆PA317／GKZl備用(同第一部分)。(2)運(yùn)用基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)，以GKZl與mhPINS病毒共同感染HepG2細(xì)胞，G418挑選抗性細(xì)胞克隆，通過Western-blot及RIA檢測(cè)抗

13、性細(xì)胞中GKZl與mhPINS基因表達(dá)，選取聯(lián)合表達(dá)成熟胰島素與GK的HepG2細(xì)胞克隆，命名為細(xì)胞“B”；以RT-PCR對(duì)細(xì)胞“B”中GKZl與mhPINS基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行鑒定，并對(duì)細(xì)胞“B”行葡萄糖刺激的胰島素分泌反應(yīng)檢測(cè)。 結(jié)果：(1)構(gòu)建的pL-GKZl．SN重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)酶切鑒定正確；所獲PA317／GKZl產(chǎn)毒細(xì)胞克隆，其病毒滴度可達(dá)106CFU／mL；PCR、RT-PCR證實(shí)PA317／GKZl細(xì)胞中已有GKZl

14、基因的整合及轉(zhuǎn)錄。(2)Western-blot及RIA選取并證實(shí)細(xì)胞“B”中有兩個(gè)目的基因(GKZl、mhPINS)的表達(dá)；RT-PCR證實(shí)細(xì)膨‘B”中有GKZl與mhPINS基因轉(zhuǎn)錄；葡萄糖刺激的胰島素分泌檢測(cè)顯示，細(xì)胞“B”具有葡萄糖刺激的胰島素分泌能力，其胰島素分泌開始于葡萄糖濃度為0．75—1．00mmol／L時(shí)，最大胰島素分泌出現(xiàn)在葡萄糖濃度為1．75-2．00mmol／L時(shí)。 結(jié)論：通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基因共轉(zhuǎn)