Glut-1反義寡核苷酸對人肝癌HepG2細(xì)胞Glut、MMP-2、MT-MMP表達(dá)及對HepG2細(xì)胞葡萄糖吸收的影響.pdf

1、研究背景:肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見和最致命的惡性腫瘤之一,近年來無論是HCC的發(fā)病率,還是HCC的死亡率都在上升。上世紀(jì)九十年代以來,在我國肝癌已排位癌癥死亡率的第二位。以根治性肝癌切除術(shù)為主的綜合治療或以肝移植術(shù)為主的綜合治療是目前臨床上HCC的主要治療方法,但只有少數(shù)HCC患者可獲得及時的根治性肝癌切除術(shù)或肝移植術(shù)治療,大多數(shù)HCC患者或者由于供肝短缺得不到及時的肝移植,或者因已

2、處于病程的進(jìn)展期或晚期,而無法得到手術(shù)治療的機(jī)會,這些HCC患者的預(yù)后很差。而對于有機(jī)會獲得根治性肝癌切除術(shù)或肝移植術(shù)治療的肝癌患者,術(shù)后腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)依然嚴(yán)重制約著肝癌的臨床治療效果。肝癌的基因研究和基因治療有望通過基因水平上的操作和介入來干預(yù)疾病的發(fā)生、發(fā)展和進(jìn)程,從而達(dá)到治療肝癌和預(yù)防肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的目的。通過對腫瘤的能量供應(yīng)進(jìn)行有效的抑制來控制甚至消滅腫瘤是一個十分吸引人的思路。有研究表明:(1):葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(gl

3、ucosetransporter-1,Glut-1)是癌細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的關(guān)鍵限速因子,腫瘤細(xì)胞在乏氧環(huán)境中通過Glut-1的高表達(dá)來提高能量供應(yīng),使腫瘤得以生存和生長,所以Glut-1與腫瘤的發(fā)生、生存和發(fā)展密切相關(guān)。(2):基質(zhì)金屬蛋白酶2(MatrixMetalloproteinase-2,MMP-2)、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(Merebrane Type-MMP,MT-MMP)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān),它們可以通過降解細(xì)胞外

4、基質(zhì)、調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附以及促進(jìn)新血管的形成來影響惡性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。目前,對于Glut-1反義寡核苷酸是否能通過抑制HCC細(xì)胞的Glut-1表達(dá)、進(jìn)而抑制MMP-2、MT-MMP表達(dá)及細(xì)胞對葡萄糖的吸收,以至預(yù)防或抑制HCC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā),國內(nèi)外尚無類似報道。
　　 研究目的:本課題擬研究Glut-1反寡義核苷酸對人肝癌HepG2細(xì)胞Glut-1、MMP-2、MT-MMP表達(dá)的抑制作用及其對HepG2細(xì)胞的葡萄糖吸收的

5、影響,以探討Glut-1作為原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌治療靶點(diǎn)的可能性。
　　 研究方法:按實(shí)驗(yàn)設(shè)計要求將HepG2細(xì)胞分為4組:未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對照組,GLUT-1pcDNA3.1組,反義GLUT-1pcDNA3.1組,pcDNA3.1空載體對照組。用雙酶切法構(gòu)建pcDNA3.1(+)-Glut-1和pcDNA3.1(+)-反義Glut-1；常規(guī)進(jìn)行HepG2細(xì)胞培養(yǎng)制備實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞；使用Lipofectamine2000試劑將空pcDNA3

6、.1、pcDNA3.1-anti-Glut(+)、pcDNA3.1-Glut(+)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入HepG-2細(xì)胞；按廠家方案,對以上三組及另一組未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞按分組要求進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、擴(kuò)增,達(dá)到要求后將各組細(xì)胞凍存,各取部分細(xì)胞進(jìn)行有關(guān)檢測:1.PCR鑒定轉(zhuǎn)染成功:2.RT-PCR檢測Glut-1、MMP-2、MT-MMP的表達(dá)水平；3.Western blotting檢測Glut-1蛋白的表達(dá)水平；4.各組用葡萄糖刺激1小時

7、后,分別收集培養(yǎng)上清,檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的葡萄糖濃度。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用mean±standard deviation(M±SD)來表示,使用軟件SPSS(Version16.0)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,采用獨(dú)立樣本的T檢驗(yàn)來確定P值。P<0.05有統(tǒng)計學(xué)上的意義。
　　 研究結(jié)果:檢測結(jié)果顯示:1.質(zhì)粒GLUT-1pcDNA3.1和反義質(zhì)粒GLUT-1pcDNA3.1均已按要求成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入相關(guān)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中；2.與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對照組、GLUT-

8、1pcDNA3.1組比較,反義GLUT-1pcDNA3.1組的Glut-1 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05),而與pcDNA3.1空載體對照組比較則無下降；3.反義GLUT-1pcDNA3.1組的MMP-2 mRNA,MT-MMP mRNA的表達(dá)低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對照組、GLUT-1pcDNA3.1組和pcDNA3.1空載體對照組；4.與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對照組、GLUT-1pcDNA3.1組和pcDNA3.1空載體對照組比較,反義GLUT-1

9、pcDNA3.1組的Glut-1蛋白表達(dá)下降；5.反義GLUT-1pcDNA3.1組的葡萄糖吸收低于GLUT-1pcDNA3.1組和pcDNA3.1空載體對照組,但高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對照組。
　　 研究結(jié)論:(1):Glut-1反義寡核苷酸可下調(diào)人肝癌HepG2細(xì)胞的Glut-1表達(dá)、降低Glut-1蛋白生成水平,并抑制HepG2細(xì)胞對葡萄糖的吸收,提示以Glut-1作為治療靶點(diǎn),通過抑制HCC細(xì)胞的Glut-1mRNA表達(dá)、Glu

10、t-1蛋白生成和HCC細(xì)胞對葡萄糖的吸收,有望降低或者阻斷HCC的能量供應(yīng),達(dá)到抑制HCC腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的治療目的。
　　 (2):Glut-1反義寡核苷酸可下調(diào)人肝癌HepG2細(xì)胞的MMP-2mRNA和MT-MMPmRNA表達(dá)水平,提示以Glut-1作為治療靶點(diǎn),有可能可以通過抑制HCC細(xì)胞的MMP-2mRNA和MT-MMPmRNA表達(dá),降低甚至阻斷HCC細(xì)胞的降解細(xì)胞外基質(zhì)、調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附以及促進(jìn)新血管的形成的能力,從而降