利用人工設(shè)計(jì)小RNA抑制銅綠假單胞菌的致病因子表達(dá).pdf

1、銅綠假單胞菌是臨床常見的機(jī)會(huì)性致病菌,也是目前抗生素耐藥最嚴(yán)重的病原菌之一。近幾年來,人們提出了靶向細(xì)菌致病力的抗感染新思路。針對(duì)細(xì)菌的某些特定致病機(jī)制(如結(jié)合、侵入、毒素分泌、破壞宿主防護(hù)和信息系統(tǒng)等),靶向阻斷其致病過程,從而剝奪其致病力,達(dá)到抗感染的目的。與傳統(tǒng)的抗感染思路完全不同,它不影響細(xì)菌生長(zhǎng),因此不會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌耐藥現(xiàn)象,也避免了抗生素所造成的體內(nèi)微生態(tài)紊亂,為有效地控制細(xì)菌感染帶來了新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。
　　 最近,在細(xì)

2、菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一類普遍存在、長(zhǎng)度在50～200個(gè)核苷酸、不能編碼蛋白質(zhì)的RNA.,稱為細(xì)菌非編碼小RNA(sRNA)。sRNA在細(xì)菌的物質(zhì)代謝、環(huán)境適應(yīng)、細(xì)菌致病力等方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。在真核生物中,RNAi技術(shù)作為一種基因沉默的有效工具得到了廣泛的應(yīng)用,并且已發(fā)展成為一種最有前途的疾病防治新方法。在前期研究中,我們分析了大腸桿菌內(nèi)源非編碼小RNA的結(jié)構(gòu)特征,首次建立了人工反式編碼小RNA(artificial trans-encod

3、ed sRNA,atsRNA)的設(shè)計(jì)原則,并在大腸桿菌中成功地對(duì)靶基因進(jìn)行了有效的沉默。本文旨在利用人工設(shè)計(jì)反式編碼小RNA干擾銅綠假單胞菌的毒力因子表達(dá)并降低致病力,為抗感染和解決細(xì)菌耐藥難題提供嶄新的技術(shù)和方法。
　　 首先,我們分析了己知銅綠假單胞菌內(nèi)源非編碼小RNA的共同結(jié)構(gòu)特征,提出了針對(duì)銅綠假單胞菌的atsRNA設(shè)計(jì)原則。以銅綠假單胞菌單基因控制的毒力因子彈性蛋白酶和外毒素A為靶點(diǎn),分別設(shè)計(jì)了SRLB和SRTX系列a

4、tsRNAs;在銅綠假單胞菌中過量表達(dá)atsRNA,并檢測(cè)靶基因表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,彈性蛋白酶在SRLB2的干擾下,蛋白表達(dá)水平降低了57％,mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降34.9％;外毒素A在SRTX1作用下轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)降低了30.6％。
　　 其次,針對(duì)phzABCDEFG操縱子控制的毒力因子綠膿菌素,設(shè)計(jì)了SRphF系列和SRpzA系列atsRNAs。其中SRphF系列的靶基因phzF是phz操縱子中的第六個(gè)基因,編碼綠膿菌素合

5、成的關(guān)鍵酶;SRpzA系列的靶基因phzA是phz操縱子第一個(gè)基因,與phz啟動(dòng)子區(qū)域緊密相連。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SRphF系列小:RNA干擾效果不明顯,效果最好的SRphF2只使綠膿菌素合成量降低了15.8％;而SRphLA系列干擾效果較好,SRpzA2干擾效率達(dá)到56％,SRpzA3能達(dá)到37％。以上說明,以操縱子控制的毒力因子為靶標(biāo)設(shè)計(jì)atsRNA時(shí),操縱子最前端基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)是有效干擾靶點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建了靶基因-熒光蛋白融合

6、載體pACYC-T7-phzF-EGFP,并在大腸桿菌BL21中共表達(dá)了SRphF系列atsRNAs和pACYC-T7-phzF-EGFP。熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,在銅綠假單胞菌中干擾效率極低的SRphF系列人工反式編碼小RNA在大腸桿菌BL21內(nèi)干擾效果顯著,SRphF2、3、5干擾后熒光表達(dá)量均有下降。其中SRphF2干擾后,pACYC-T7-phzF-EGFP熒光表達(dá)量下降了83.5％,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其在銅綠假單胞菌種的干擾效率15.4％。這

7、一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,兩種細(xì)菌中atsRNAs的干擾作用存在一定差異。
　　 最后,針對(duì)銅綠假單胞菌群體感應(yīng)rhl和las系統(tǒng)的調(diào)控蛋白R(shí)hlR和LasR設(shè)計(jì)了SRlaR和SRrhR系列的atsRNAs。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,SRrhlR4使PAO1菌株rhlR在mRNA水平上降低了79％,并使受rhl系統(tǒng)控制的下游彈性蛋白酶活力降低了36.4％;SRlaR3降低了lasR mRNA的63％,彈性蛋白酶活力降低了32.7％。近年來

8、的研究表明,干擾細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)可以作為潛在的防治細(xì)菌病害的新途徑,我們通過SRlaR和SRrhR系列的atsRNAs成功干擾了rhlR、lasR基因的表達(dá),并一定程度上降低了毒力因子彈性蛋白酶的合成。
　　 綜上所述,我們初步建立了一種在銅綠假單胞菌中利用atsRNA干擾毒力因子表達(dá)的方法。通過對(duì)單基因控制的毒力靶點(diǎn)、操縱子控制的綠膿菌素以及群體感應(yīng)調(diào)控基因的有效干擾,從一定程度上降低了銅綠假單胞菌的致病力,為銅綠假單胞菌引