內毒素致傷新生大鼠腸組織ICAM-1、氧化應激及金屬硫蛋白的變化.pdf

1、壞死性小腸結腸炎(Necrotizingenterocolitis，NEC)是新生兒期最嚴重的胃腸道疾病。文獻首次報道新生兒NEC是在二十世紀60年代中期，盡管由于肺表面活性物質的應用及醫(yī)務人員綜合素質的提高，許多小早產兒得以存活，但NEC發(fā)病率并未下降，并認為NEC將取代肺疾病而成為早產兒死亡的主要原因。在美國，每1000例活產嬰兒中就有1～3例發(fā)生NEC，每年有2000～4000例新生兒患該病，其中27％～63％需外科手術治療。根據

2、流行并學調查，國外占極低出生體重兒的10％～26％，國內亦呈逐年上升趨勢；其病死率高達10％～30％。而且，根據Bell's分級，NEC嚴重程度與出生體重及胎齡呈負相關，甚至有報道出生體重低于1000g，胎齡小于28w的超低出生體重兒其病死率高達100％。 引起NEC的病因很多，主要包括早產、腸道配方乳喂養(yǎng)、感染及腸缺氧/缺血。多種病因與新生兒不成熟的腸粘膜屏障協(xié)同作用導致粘膜屏障功能破壞，觸發(fā)炎癥連鎖反應，引起NEC。其特征性

3、病理改變?yōu)槟绦曰蛉毖阅c壞死。 盡管經過40多年研究，其發(fā)病機制仍不清楚，仍是新生兒死亡的主要原因之一。存活者常發(fā)生腸狹窄、短腸綜合癥等。過去，認為NEC的存活者到兒童期有正常的神經認知發(fā)育，但最近提出，其腦發(fā)育遲緩的發(fā)生率增加。而且，據調查數據顯示，NEC是監(jiān)測極低出生體重兒神經發(fā)育預后的獨立危險因素。因而了解NEC病因及發(fā)病機制，對于尋找其有效的治療和預防措施具有重要意義。目前國外研究人員推測NEC可能的發(fā)病機制有：始發(fā)環(huán)

4、節(jié)可能是血小板活化因子(PAF)與脂多糖(LPS)和/或TNFα協(xié)調作用觸發(fā)炎癥連鎖反應，多型核白細胞激活后與血管內皮細粘附，血管通透性增加，補體激活、NF-κB活化，誘導促炎細胞因子、粘附分子、炎癥介質和ROS釋放，最后血管收縮，導致缺血/再灌注。來自黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)的大量活性氧(ROS)導致氧化應激損傷是腸損傷的最終途徑。能否發(fā)生NEC或NEC的嚴重程度取決于損傷機制和防御機制(主要為nNOS)之間的平衡。若前者占優(yōu)勢將導致粘膜屏障

5、功能嚴重受損，腸損傷，細菌入侵，最終形成惡性循環(huán)，導致休克、敗血癥，甚至死亡。目前有關NEC的研究很多，國外學者為研究NEC建立許多動物模型，大致分為三種： 1.血小板活化因子(PAF)、脂多糖和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘發(fā)腸壞死 2.缺氧+LPS/缺氧引發(fā)NEC 3.缺氧、腸喂養(yǎng)和PAF誘導新生動物NEC 上述模型從不同角度闡述了新生兒NEC的發(fā)生、發(fā)展過程，但均不能完美解釋人類NEC。NEC時腸

6、粘膜屏障功能失調，活性氧是其腸損傷的最終途徑，氧化與抗氧化失衡是NEC重要的發(fā)病機制之一。 中性白細胞(PMN)激活后與腸粘膜內皮細胞粘附，促發(fā)炎癥連鎖反應，是其發(fā)病的始發(fā)環(huán)節(jié)。細胞間粘附分子-1(ICAM-1)在該過程中發(fā)揮重要作用。ICAM-1表達于內皮細胞，介導白細胞與內皮細胞的牢固黏附。在人類許多炎癥過程及動物腸缺血/再灌注、腸移植和敗血癥模型中，其表達對PMN的聚集具有重要作用。已有研究表明LPS可誘導腸組織ICAM-

7、1的表達。Sun等人發(fā)現P-選擇素缺陷小鼠和細胞間粘附分子-1(ICAM-1)缺陷小鼠(經巖藻素-選擇素抑制治療后)可抵御PAF造成的損害，表明粘附分子在腸損傷中的重要作用。有關ICAM-1在新生鼠腸損傷中的表達如何，及其在NEC發(fā)生中的動態(tài)變化，目前尚不清楚。 來自黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)的大量活性氧(ROS)導致氧化應激損傷是腸損傷的最終途徑。NEC歸類于所謂的“新生兒自由基疾病”。在NEC患兒及NEC實驗動物模型均發(fā)現存在高水平的

8、促炎細胞因子、一氧化氮(NO)和ROS。 谷胱甘肽(glutathione，GSH)是體內重要的抗氧化物。維持細胞內氧化-還原平衡。參與細胞信號調節(jié)和基因轉錄。直接與ROS作用，并能與NO反應，限制過氧亞硝酸ROS的產生，發(fā)揮解毒功能。GSH氧化/還原比率是評價氧化應激的重要指標。有研究認為腸缺血/再灌注損傷時，GSH含量降低。全身炎癥反應和敗血癥時GSH合成必需的氨基酸，可增加血GSH濃度，改善預后。GSH在NEC中變化尚存在

9、爭議：Haase在新生豬缺氧/復氧的NEC模型中發(fā)現GSH降低；Hall等在NEC患兒血中并未發(fā)現總GSH有所下降。 金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一種低分子量、富含半胱氨酸的重金屬結合蛋白，具有抗氧化作用，是一種有效的自由基清除劑。作為一種新型抗氧化劑，其在新生鼠腸損傷中的作用尚不清楚。Takano等研究證明內源性MT在乙醇誘發(fā)的胃十二指腸損傷中具有細胞保護作用。另有研究發(fā)現給予鋅制劑誘導MT合成，但對實

10、驗性結腸炎無影響。Oz等研究認為MT過度表達對炎癥性腸病的發(fā)生、發(fā)展無影響。國內外尚未見動態(tài)研究金屬硫蛋白(MT)在新生鼠腸損傷中的作用。 本研究以LPS致新生大鼠腸損傷為對象，應用形態(tài)學和分子生物學等檢測方法，動態(tài)觀察小腸形態(tài)的演變過程；研究谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)的變化；探討ICAM-1在新生鼠腸損傷中的表達和調控機制；研究金屬硫蛋白在新生鼠腸損傷中的動態(tài)變化及作用機制。旨在闡明新生兒NEC是腸粘膜屏障損傷機制與內源性防御機制失衡

11、的結果，為完善新生兒NEC的發(fā)病機制及尋求有效的防治措施奠定實驗基礎。 材料與方法一、動物模型健康24小時內新生Wistar大鼠，隨機分為實驗組腹腔注射5mg/kgEcoliO55：B5內毒素，對照組注射等量生理鹽水。注射后各組均放回母鼠旁，繼續(xù)哺乳，直至實驗結束。 二、實驗標本采集及處理實驗組分別于LPS注射后1h、3h、6h、12h和24h隨機處死后分離胃腸道。用于回腸形態(tài)學觀察、免疫組織化學檢測的標本置于4.0％多

12、聚甲醛中固定；其余標本置于DEPC浸泡的Eppendorf管中，于-80℃超低溫冰箱中保存。 三、實驗方法及檢測指標1.回腸形態(tài)學研究(1)大體觀察：各組于相應的時間點處死后，打開腹腔，觀察腸大體改變。 (2)光鏡下觀察：固定后的回腸組織常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片5μm，HE染色，觀察其病理改變，進行腸損傷評分。 2.回腸組織蛋白及基因水平研究(1)谷胱甘肽(GSH)，氧化型谷胱甘肽(GSSG)，谷胱甘肽過氧化物酶

13、(GSH-Px)，髓過氧化物酶(MPO)，丙二醛(MDA)，二氨氧化酶(DAO)及腸組織蛋白含量的測定采用化學方法。 (2)免疫組織化學方法用于回腸組織細胞間粘附分子-1(ICAM-1)和金屬硫蛋白(MT)的定位和蛋白表達檢測。 (3)RT-PCR法檢測回腸組織ICAM-1、MT1、MT2mRNA的表達。 四、統(tǒng)計學分析所有數據以均數±標準差(-X±S)表示，經SPSS13.0forwindows數據分析軟件處理

14、。組間比較進行t檢驗，相關分析采用Spearman分析。統(tǒng)計結果顯著性以P＜0.05表示。 結論：1.LPS誘導的新生鼠腸損傷模型在臨床特點和病理變化上符合新生兒NEC的發(fā)生、發(fā)展特征。 2.GSH抗氧化系統(tǒng)抗氧化能力的降低，引起氧化-抗氧化失衡在新生鼠腸損傷中起重要作用，可能是NEC發(fā)生的重要機制之一。 3.LPS作用于新生大鼠后，通過上調ICAM-1蛋白和基因表達，使PMN牢固粘附于腸上皮細胞，進而通過增加活