SHR大鼠心血管重構(gòu)中VPO1表達(dá)變化及氯沙坦的干預(yù)作用.pdf

1、第一章 VPO1在不同周齡自發(fā)性高血壓大鼠血管重構(gòu)中的作用及機(jī)制
　　研究背景：
　　高血壓(Hypertension)是一種以體循環(huán)動(dòng)脈收縮期和（或）舒張期血壓持續(xù)升高為主要特點(diǎn)的全身性疾病，其主要病理改變是血管重構(gòu)和左心室肥厚，涉及實(shí)質(zhì)細(xì)胞（如心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞）和間質(zhì)細(xì)胞（如心肌成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)）的改變，引起心肌細(xì)胞體積增大和間質(zhì)增生，加上由于高血壓時(shí)血管阻力增加引起左心室后負(fù)荷相應(yīng)的增加，導(dǎo)致左心室

2、肥厚，疾病進(jìn)一步惡化可導(dǎo)致左心衰竭;在血管表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞功能不全、平滑肌細(xì)胞增生肥大和細(xì)胞外基質(zhì)沉積等。血管重構(gòu)和左心室重構(gòu)是高血壓發(fā)生發(fā)展過程的中心環(huán)節(jié)。大量研究表明氧化應(yīng)激（Oxidative stress）是高血壓血管重構(gòu)和左心室重構(gòu)的主要機(jī)制之一。
　　氧化應(yīng)激是指機(jī)體活性氧(Reactive oxygen species，ROS)過量蓄積引起的氧化損傷。NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NOX)和過氧化物酶是

3、血壓調(diào)節(jié)中產(chǎn)生活性氧的重要來源。血管過氧化物酶1(Vascular peroxidase1，VPO1)是新近報(bào)道的一種主要存在于心血管系統(tǒng)中的含有血紅素的過氧化物酶。已有研究表明VPO1類似于髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO），能將H2O2（弱氧化劑）催化成為HOCl（強(qiáng)氧化劑），促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞損傷。故推測(cè)VPO1可能在氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。
　　本章選取不同周齡SHR與同周齡WKY大鼠模型對(duì)比，觀察VPO1表

4、達(dá)與胸主動(dòng)脈及腸系膜動(dòng)脈血管重構(gòu)及氧化應(yīng)激程度的關(guān)系，以及氯沙坦處理對(duì)高血壓大鼠血管重構(gòu)的影響以及其可能涉及的機(jī)制。
　　方法：
　　選取4周齡雄性體重在65-85g/只的自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)，適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，48只SHR大鼠隨機(jī)分為6組進(jìn)行飼養(yǎng)，每組8只，同時(shí)選取周齡、性別、體重匹配的Wistar-Kyoto大鼠(WKY)32只作為對(duì)照組:
　?、?/p>

5、5周齡(week-old，wks)的SHR和WKY組（SHR5和WKY5）;
　　②8周齡SHR和WKY組（SHR8和WKY8）;
　?、?3周齡SHR和WKY組（SHR13和WKY13）;
　?、?0周齡SHR和WKY組（SHR20和WKY20）;
　　⑤低劑量Losartan組(15mg/kg/day，Los(L));
　?、薷邉┝縇osartan組(30mg/kg/day，Los(H))。
　　

6、其中Los(L)組和Los(H)組SHR大鼠從13周齡開始給予上述劑量的氯沙坦（Losartan）灌胃，SHR組及WKY組給予等體積的生理鹽水灌胃，動(dòng)物每周稱重，以調(diào)整給藥量。常規(guī)喂養(yǎng)至20周齡后終止實(shí)驗(yàn)。經(jīng)左頸總動(dòng)脈插管測(cè)定大鼠動(dòng)脈收縮壓(Systolic blood pressure，SBP)，收集血液并測(cè)定血漿中血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)、過氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)的濃度。測(cè)定

7、主動(dòng)脈組織勻漿中NADPH氧化酶(NOX)活性，分別提取腸系膜動(dòng)脈組織RNA、胸主動(dòng)脈RNA和蛋白;用Real-time PCR和Western Blot檢測(cè)VPO1的表達(dá);4％多聚甲醛固定胸主動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈，石蠟包埋，用于蘇木精-伊紅（HE）和Masson染色以及免疫組化等形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.與同周齡WKY大鼠比較，SHR8、SHR13、SHR20大鼠血壓顯著升高，SHR13、SHR20大鼠胸主動(dòng)脈及腸系膜

8、動(dòng)脈血管重構(gòu)明顯;
　　2.與同周齡WKY大鼠比較，SHR8、SHR13、SHR20大鼠血漿AngⅡ、H2O2水平顯著升高(P＜0.05)，主動(dòng)脈組織勻漿NADPH氧化酶活性明顯增高，且SHR20大鼠升高幅度更大;
　　3.與同周齡WKY大鼠比較，SHR8、SHR13、SHR20大鼠腸系膜動(dòng)脈組織中VPO1的mRNA水平，以及胸主動(dòng)脈組織中VPO1的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào);
　　4.Losartan干預(yù)呈濃度依

9、賴性降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓，逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)，同時(shí)降低SHR大鼠血漿中H2O2的濃度，降低主動(dòng)脈組織中NOX活性，降低VPO1蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.高血壓大鼠血管重構(gòu)的機(jī)制與氧化應(yīng)激程度升高有關(guān);且VPO1表達(dá)上調(diào)與血管重構(gòu)相關(guān)，其機(jī)制可能涉及NOX/VPO1途徑;
　　2.Losartan具有抗高血壓大鼠血管重構(gòu)的作用，其機(jī)制可能與抑制NOX/VPO1途徑，使氧化應(yīng)激程度減輕有關(guān)。
　　第二章 VPO

10、1在不同周齡自發(fā)性高血壓大鼠左室重構(gòu)中的作用及機(jī)制
　　研究背景：
　　心肌重構(gòu)(myocardial remodelling)是指在多種病理情況下（如壓力超負(fù)荷、缺血、高腎素水平等）心肌組織作出的適應(yīng)性反應(yīng)，包括心肌細(xì)胞肥大、間質(zhì)纖維化、心肌細(xì)胞凋亡等。高血壓早期的重構(gòu)在短期內(nèi)對(duì)正常心功能的維持具有一定的積極作用，但長(zhǎng)期持續(xù)的重構(gòu)會(huì)導(dǎo)致心功能逐漸惡化以至失代償而出現(xiàn)心力衰竭。新近研究表明，氧化應(yīng)激在高血壓左心室重構(gòu)中發(fā)揮重

11、要作用。機(jī)體內(nèi)活性氧的大量蓄積和/或抗氧化能力的降低導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷。機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生ROS的酶系主要包括NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NOX)、過氧化物酶、黃嘌呤氧化酶、單胺氧化酶等。VPO1作為新發(fā)現(xiàn)的含血紅素的過氧化物酶家族成員之一，其主要在心血管系統(tǒng)中表達(dá)，鑒于其具有將H2O2(弱氧化劑)催化生成HOC1的特性，本章節(jié)繼續(xù)以不同周齡的自發(fā)性高血壓大鼠為模型，探討VPO1在高血壓心肌重構(gòu)中的作用及機(jī)制;并探討氯沙坦抗心肌

12、重構(gòu)的作用及機(jī)制。
　　方法：
　　基于第一章中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組：
　　①SHR5和WKY5；
　?、赟HR8和WKY8；
　?、跾HR13和WKY13；
　?、躍HR20和WKY20；
　?、軱os(H)；
　　⑥Los(L)等6組動(dòng)物在最終處理前完成超聲心動(dòng)圖觀察心臟結(jié)構(gòu)的形態(tài)及心功能指標(biāo)。
　　分離全心臟并稱重（Heart weight，HW）、游離左心室并稱重(Left vent

13、ricular weight，LVW)，游離大鼠右側(cè)脛骨并測(cè)量其長(zhǎng)度(Tibia length，TL)，計(jì)算LVW/HW和LVW/TL比值。4％多聚甲醛固定左心室，石蠟包埋，用于蘇木精-伊紅（HE）和Masson染色以及免疫組化等形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn);分別提取左心室組織RNA和蛋白，用Real-time PCR檢測(cè)心肌肥大標(biāo)志物腦鈉素(brainnatriuretic peptide，BNP)、α-骨骼肌動(dòng)蛋白(α-skeletal actin，

14、α-SA)、β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC) mRNA表達(dá)的變化;檢測(cè)心肌纖維化標(biāo)志物Ⅰ、Ⅲ型膠原(collagenⅠ，collagenⅢ)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF) mRNA表達(dá)的變化;檢測(cè)心肌凋亡指標(biāo)Bax和Bcl-2。測(cè)定左心室組織勻漿中次氯酸(hypochlorous acid，HOCl)、H2O2的濃度、NADPH氧化酶(NOX)的活性;Western Blot檢測(cè)NOX2、VPO1

15、的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.與同周齡WKY大鼠比較，SHR8、SHR13、SHR20大鼠血壓顯著升高，SHR13、 SHR20大鼠舒張末期左室后壁和室間隔顯著增厚，左室舒張功能下降，收縮功能無明顯變化;
　　2.與同周齡WKY大鼠比較，SHR13、SHR20大鼠膠原沉積明顯增多，BNP、α-SA、β-MHC、Ⅰ、Ⅲ型膠原、CTGF以及Bax的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2顯著下調(diào);
　　3.與同周齡WKY大鼠

16、比較，SHR8、SHR13、SHR20大鼠左心室組織勻漿中HOCl、H2O2濃度和NOX活性顯著上調(diào)，且NOX2、VPO1的mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào);
　　4.與對(duì)照組比較，Losartan干預(yù)呈濃度依賴性抑制自發(fā)性高血壓大鼠的左心室重構(gòu)，同時(shí)降低SHR大鼠中左心室組織中HOCl、H2O2濃度和NOX活性，降低NOX2和VPO1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.高血壓大鼠左室重構(gòu)，其機(jī)制可能與氧化應(yīng)激程度升高有關(guān)，且

17、VPO1表達(dá)與左室重構(gòu)相關(guān)，其機(jī)制可能涉及NOX/VPO1途徑;
　　2.Losartan具有抗高血壓大鼠左室重構(gòu)的作用，其機(jī)制可能與抑制NOX/VPO1途徑，使氧化應(yīng)激程度降低有關(guān)。
　　第三章 VPO1在不同周齡自發(fā)性高血壓大鼠內(nèi)皮功能中的作用及機(jī)制
　　研究背景：
　　高血壓是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素，越來越多的證據(jù)表明活性氧(ROS)的大量蓄積引起氧化應(yīng)激是高血壓的主要發(fā)病機(jī)制。高血壓中心臟、腎臟和中樞神

18、經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生ROS的酶系有黃嘌呤氧化酶、未偶聯(lián)型一氧化氮合酶(NOS)、線粒體呼吸酶和NADPH氧化酶(NOX)。心血管系統(tǒng)中產(chǎn)生ROS的主要來源是NOX，它能催化產(chǎn)生超氧化物及下游其他活性氧。NOX家族成員共有7種催化亞單位，即NOX1-5和Duox1和Duox2（雙氧化酶）。到目前為止，證實(shí)在哺乳動(dòng)物的心血管系統(tǒng)中NOX催化亞單位主要是NOX2和NOX4。
　　過氧化物酶在體內(nèi)分布廣泛，具有高度細(xì)胞/組織分布特異性。它參與宿主的

19、防御反應(yīng)，參與生物合成甲狀腺激素、細(xì)胞外基質(zhì)等，在病理?xiàng)l件下能催化過氧化氫(H2O2)和氯離子產(chǎn)生次氯酸，從而氧化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA，導(dǎo)致細(xì)胞和組織。一氧化氮(NO)是內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)產(chǎn)生的血管舒張因子，維持著血管的舒張功能。eNOS合成和/或生物利用度降低導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，而血管內(nèi)皮功能障礙是高血壓導(dǎo)致靶器官損害及其并發(fā)癥發(fā)生的重要原因。
　　血管過氧化物酶1(VPO1)，新發(fā)現(xiàn)的過氧化物酶家族成員，在心血管系統(tǒng)

20、中，它主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞中表達(dá)。VPO1酶學(xué)和底物特異性類似MPO，即在弱氧化劑H2O2催化生成強(qiáng)氧化劑次氯酸，促進(jìn)血管組織的進(jìn)一步氧化應(yīng)激。
　　上述章節(jié)已經(jīng)得出結(jié)論VPO1涉及高血壓的發(fā)展，本章節(jié)繼續(xù)以不同周齡自發(fā)性高血壓大鼠為模型，探討隨著高血壓的進(jìn)展，NADPH氧化酶活性的狀態(tài)、ROS的產(chǎn)生、氧化應(yīng)激程度以及VPO1是否涉及內(nèi)皮功能障礙。
　　方法：
　　基于第一章中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組，6組動(dòng)物

21、:
　?、賁HR5和WKY5組;
　?、赟HR8和WKY8組;
　　③SHR13和WKY13組;
　?、躍HR20和WKY20組;
　　⑤Los(L)組;
　?、轑os(H)組。
　　每組8只，頸總動(dòng)脈插管測(cè)壓后收集動(dòng)脈血，測(cè)定血漿中一氧化氮(nitric oxide，NO)、過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)濃度，游離胸主動(dòng)脈測(cè)定血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)，提取胸主動(dòng)脈組織中

22、RNA和蛋白，測(cè)定組織勻漿中的次氯酸(hypochlorous acid，HOCl)、3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine)的濃度、 NADPH氧化酶(NOX)活性，用Real-time PCR或Westem Blot檢測(cè)NOX4、eNOS、VPO1的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.與同周齡WKY大鼠比較，SHR8、SHR13、SHR20大鼠血壓顯著升高，SHR13、SHR20大鼠出現(xiàn)內(nèi)皮依賴性舒張功能不全;
　

23、　2.與同周齡WKY大鼠比較，SHR8、SHR13、SHR20大鼠血漿中H2O2濃度升高，胸主動(dòng)脈勻漿中HOCl、3-硝基酪氨酸的濃度、NOX的活性以及NOX4 mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高;
　　3.與同周齡WKY大鼠比較，SHR8、SHR13、SHR20大鼠血漿NO濃度、eNOS mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低;
　　4.Losartan干預(yù)呈濃度依賴性降低大鼠胸主動(dòng)脈勻漿中HOCI、3-硝基酪氨酸的濃度、NOX的活性，降低N