真菌性角膜炎的改良玻片培養(yǎng)法的菌種鑒定及Etest法的藥物敏感性測定.pdf

1、本文研究目的：建立改良玻片培養(yǎng)法對真菌性角膜炎的分離菌株進(jìn)行菌種的鑒定和分布分析，檢測臨床分離菌株的藥物敏感性。 研究資料與方法：對2002年9月至2006年3月期間就診于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院、臨床診斷為真菌性角膜炎的216例患者進(jìn)行病原學(xué)檢查。臨床診斷主要依據(jù)病史及角膜化膿性浸潤病灶的特征表現(xiàn)。培養(yǎng)標(biāo)本取自212例臨床診斷為真菌性角膜炎并且未發(fā)生角膜穿孔病例的角膜刮取物；另外4例患者初診時角膜己穿孔，因此初診時未進(jìn)行病

2、原培養(yǎng)，但對進(jìn)行治療性角膜移植術(shù)(therapeuticpenetratingkeratoplasty，T-PKP)后取下的受體角膜材料進(jìn)行進(jìn)一步的病原培養(yǎng)。標(biāo)本直接接種到血、巧克力、Sabouraud右旋糖(Sabourauddextroseagar，SDA)和伊紅美蘭四個瓊脂培養(yǎng)基上，置適宜溫度下培養(yǎng)。培養(yǎng)陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：2個或2個以上的培養(yǎng)皿在原接種區(qū)域生長同一色澤及形態(tài)的菌落。觀察并拍照記錄各培養(yǎng)菌落的形態(tài)、色澤及生長情況。再

3、采用我們建立的一種改良玻片培養(yǎng)法對分離菌株進(jìn)行菌種鑒定，方法如下：將在SDA培養(yǎng)基上生長良好菌落的1/4轉(zhuǎn)接種至另一SDA培養(yǎng)基上，以接種點(diǎn)為直角頂點(diǎn)放置20×20mm的消毒蓋玻片，室溫下培養(yǎng)2～4天，當(dāng)菌絲沿著蓋玻片的兩邊向玻片內(nèi)生長到一定程度時，將玻片小心取出翻轉(zhuǎn)后貼在滴有乳酸酚棉藍(lán)染液的載玻片上，用25×50mm蓋玻片壓片，在顯微鏡下觀察并拍照記錄菌絲、孢子的形態(tài)以及它們之間的關(guān)系，最后綜合菌落形態(tài)、色澤及生長速度鑒定菌屬和菌種。

4、若培養(yǎng)分離到的為酵母菌，需根據(jù)生物梅里埃鑒定卡對菌種進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。采用Etest法分別測定分離菌種對氟康唑(fluconazole，F(xiàn)L)、伊曲康唑(itraconazole，IT)及兩性霉素B(amphotericinB，AP)的藥物敏感性。方法如下：制備孢子濃度為0.5-5×106CFU/ml的真菌混懸液，用消毒細(xì)菌涂布器將真菌混懸液均勻涂敷在RPMI1640瓊脂培養(yǎng)基的表面，加蓋干燥15分鐘后，將氟康唑(FL)、伊曲康唑(IT)

5、、二性霉素B(AP)三種藥物的Etest測試條(ABBIODISK，Solna，Sweden)貼到培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿置35C、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，根據(jù)抑菌環(huán)與測試條相交點(diǎn)的刻度讀出最低抑菌濃度(MinimalInhibitConcentration；MIC)值。藥物敏感的判斷標(biāo)準(zhǔn)：氟康唑MIC值≤64ug/ml、伊曲康唑MIC值≤1.0ug/ml、二性霉素BMIC值≤1.0ug/ml，判斷相應(yīng)菌株對相應(yīng)藥物敏感。 研

6、究結(jié)果：臨床診斷為真菌性角膜炎的216只眼中，真菌病原培養(yǎng)陽性者為164例165株，陽性率76.4％。共分離到16個菌屬38個菌種。菌種分布為：絲狀菌160株(97.0％)，酵母菌3株(1.8％)，雙相菌2株(1.2％)。絲狀菌的菌種分布：鐮刀菌(n=77，46.7％)，曲霉菌(n=23，13.9％)，暗色菌(n=21，12.7％)，頂孢霉菌(n=12，7.3％)，以及其他少見菌種共27株(16.4％)。21株暗色菌的具體菌種分布：彎孢

7、霉(n=8，4.8％)、鏈隔孢(n=8，4.8％)、單隔孢(n=2，1.2％)、平臍蠕孢霉(n=2，1.2％)、突臍蠕孢霉(n=1，0.6％)。少見絲狀菌種包括金孢霉(n=5，3.0％)、毛癬菌(n=3，1.8％)、炭疽菌(n=3，1.8％)、輪枝孢菌(n=1，0.6％)、足分支菌(n=1，0.6％)。另外，有14株(8.5％)的絲狀菌采用目前的鑒定方法無法辨析具體菌種。分離到的酵母菌均為念珠菌(n=3，1.8％)。分離到雙相菌分別為芽

8、生菌(n=1，0.6％)和孢子絲菌(n=1，0.6％)。另外，從一個患者的角膜標(biāo)本上同時分離到2個菌種，分別為突臍蠕孢霉菌和近平滑念珠菌。 藥物敏感試驗(yàn)的檢測結(jié)果如下：77株鐮刀菌對二性霉素B敏感的有37株(48.1％)，對伊曲康唑敏感的有1株(1.3％)，對氟康唑敏感的有2株(2.6％)。23株曲霉菌對伊曲康唑均敏感，對二性霉素B敏感的有9株(39.1％)，對氟康唑敏感的有2株(8.7％)。21株暗色菌對二性霉素B均敏感，對伊

9、曲康唑敏感的有18株(85.7％)，對氟康唑敏感的有19株(90.5％)。12株頂孢霉菌對伊曲康唑敏感的有9株(75％)，對二性霉素B敏感的有3株(25％)，對氟康唑敏感的有9株(75％)。32株其他其他絲狀菌、雙相菌和酵母菌的藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果依菌種的不同差異較大，對二性霉素B、伊曲康唑及氟康唑敏感的分別有25(78.1％)、19(59.4％)、12株(37.5％)。 研究結(jié)論：改良玻片培養(yǎng)法的菌種分布分析發(fā)現(xiàn)，有16屬38種的