細(xì)胞因子在雌小鼠內(nèi)毒素攻擊中的變化及其對(duì)卵母細(xì)胞成熟影響機(jī)理的研究.pdf

1、研究背景和研究思路 內(nèi)毒素(endotoxin)是存在于革蘭氏陰性菌外膜中的大分子脂多糖(1ipopolysaccharide,LPS)物質(zhì)，是感染性休克的主要致病因子，而細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growthfactor,EGF)、內(nèi)皮素-1(endothelin ET-1)、一氧化氮(Nitric oxide，NO)等在介導(dǎo)或保護(hù)LP

2、S引起的病理生理學(xué)變化中有著非常重要的作用。故而，阻斷細(xì)胞因子引起的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在防治內(nèi)毒素攻擊中具有重要的意義，然而至今尚未尋找到有效的內(nèi)毒素拮抗劑。 雌性激素是存在于女性體內(nèi)的正常激素，包括雌激素(以雌二醇一estradiol,E<,2>為代表)和孕激素(以孕酮—progesterone,P為代表)。 本研究工作分為四個(gè)部分： 第一部分探討小鼠動(dòng)情周期與脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)

3、所致肝 肺組織病理?yè)p傷狀態(tài)的關(guān)系及可能的機(jī)理；探討動(dòng)情周期不同階段內(nèi)毒素攻擊 時(shí)卵巢中細(xì)胞因子含量的變化。 第二部分探討不同劑量?jī)?nèi)毒素(3.0，6.0，12mg／kg)對(duì)PMSG和hCG誘導(dǎo)卵泡發(fā)育、成熟和排卵功能的影響和機(jī)理，以及E<,2>和P分別及聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)內(nèi)毒素影響卵泡發(fā)育、成熟和排卵功能的保護(hù)性作用。 第三部分用孕馬血清促性腺激素(PMSG)誘導(dǎo)未成年小鼠超排卵，口吸管吸取卵丘一卵母細(xì)胞復(fù)合物(COC)以及

4、裸卵(DO)，觀察細(xì)胞因子對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響以及雌性激素的保護(hù)性作用。 第四部分用RT-PCR，western blot和顯微注射方法觀察細(xì)胞因子影響 卵母細(xì)胞成熟的機(jī)理以及原癌基因在介導(dǎo)細(xì)胞因子影響卵母細(xì)胞成熟中的作用。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)于動(dòng)情周期不同階段行LPS攻擊，觀察在體內(nèi)不同E<，2>和P水平時(shí)LPS所致肝肺病理?yè)p傷的差異，并同步檢測(cè)血漿和卵巢中的致炎因子(TNFa)及對(duì)機(jī)體有重要保護(hù)作用的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)變

5、化，分析它們之間的相關(guān)關(guān)系，為進(jìn)一步探討雌性激素的保護(hù)作用及為臨床上防治內(nèi)毒素?fù)p傷提供依據(jù)。 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)情周期確定成年雌性昆明小白鼠，體重22-25g。用陰道涂片方法確定動(dòng)情周期，選用處于動(dòng)情期、動(dòng)情后期和動(dòng)情間期的小白鼠用于本實(shí)驗(yàn)。 2．實(shí)驗(yàn)分組 3.形態(tài)學(xué)觀察動(dòng)物處死后，留取肝、肺組織標(biāo)本，按常規(guī)制片，HE染色，光鏡觀察。 4.逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)測(cè)定腹腔巨噬細(xì)胞和肝肺、卵巢

6、組織中的TNFαmRNA表達(dá)總RNA提取 5．放射免疫法測(cè)定小鼠血漿和卵巢組織中EGF、TNF α、ET-1、E<,2>和P含量 按照放免試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。 6．紫外分光比色法測(cè)定血漿和卵巢中的NO含量 按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 動(dòng)情期和動(dòng)情后期高水平的E<,2>和P對(duì)LPS造成的組織損害有保護(hù)作用，其機(jī)理可能與降低TNFα、NO或／和ET-1產(chǎn)生和升高EGF產(chǎn)生有關(guān)。在內(nèi)毒素攻擊時(shí)，卵巢中細(xì)

7、胞因子的水平也產(chǎn)生相應(yīng)的變化。 目的和方法 雌性激素是存在于女性正常體內(nèi)的激素，包括雌激素(以雌二醇E<,2>為代表)和孕激素(以孕酮P為代表)。E<,2>和P除對(duì)生殖系統(tǒng)有影響外，還對(duì)燒傷、創(chuàng)傷、感染等傷害性刺激造成的免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等的功能紊亂和器質(zhì)性損傷具有重要的調(diào)整和保護(hù)作用。內(nèi)毒素是存在于革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜中的脂多糖成分，是感染性休克的主要刺激物，也是各種嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)由于腸

8、源性感染、毒素移位等導(dǎo)致膿毒性休克、多功能臟器衰竭等的主要應(yīng)激物。本研究旨在探討：①內(nèi)毒素應(yīng)激時(shí)對(duì)卵巢的生卵和排卵功能的影響；②雌性激素對(duì)內(nèi)毒素引響卵巢生殖功能的保護(hù)性作用。 1．實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 2.放射免疫檢測(cè)小鼠血漿中雌二醇和孕酮含量按照放免試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。 3.形態(tài)學(xué)觀察動(dòng)物處死后，留取卵巢組織，按常規(guī)制片，HE染色，光鏡觀察。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 內(nèi)毒素能干擾小鼠的卵泡發(fā)育和排卵以及卵母細(xì)胞的成

9、熟，此作用可能與抑制E<,2>和P產(chǎn)生有關(guān)；外源性E<,2>和P對(duì)內(nèi)毒素抑制卵巢的生殖功能具有保護(hù)性作用。 第三部分 細(xì)胞因子對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響以及雌性激素的作用 目的和方法 從第一部分結(jié)果可見(jiàn)，在內(nèi)毒素攻擊時(shí)，機(jī)體的細(xì)胞因子產(chǎn)生變化并由之引起肝、肺等組織的病理性損傷，尤其是卵巢中細(xì)胞因子也產(chǎn)生明顯的變化；從第二部分結(jié)果可見(jiàn)，在內(nèi)毒素攻擊時(shí)，卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞的成熟受到嚴(yán)重抑制。從中可以推測(cè)，內(nèi)毒素引進(jìn)的細(xì)胞因

10、子尤卵巢中細(xì)胞因子的變化可能會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞的成熟產(chǎn)生影響，但結(jié)果尚不清楚。本研究探討上述細(xì)胞因子對(duì)卵母細(xì)胞成熟的確切作用，探討雌性激素對(duì)細(xì)胞因子影響卵母細(xì)胞成熟的干預(yù)作用，為進(jìn)一步了解卵母細(xì)胞的成熟機(jī)理增添新資料，為證實(shí)雌性激素對(duì)生殖功能的保護(hù)性作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和復(fù)合卵與的獲取與培養(yǎng)3-4周齡健康雌性未成年昆明小白鼠，腹腔注射PMSG 8IU。 2．實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)1：觀察小鼠卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)條

11、件下的正常發(fā)育過(guò)程。以驗(yàn)證本培養(yǎng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。 實(shí)驗(yàn)2：觀察EGF對(duì)小鼠卵母細(xì)胞成熟影響的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)3：觀察TNF a對(duì)小鼠卵母細(xì)胞成熟影響的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系以及E<,2>和P的作用。 實(shí)驗(yàn)4：觀察ET-1對(duì)小鼠卵母細(xì)胞成熟影響的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系以及E<,2>和P的作用。 實(shí)驗(yàn)5：觀察NO對(duì)小鼠卵母細(xì)胞成熟影響的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系以及E<,2>和P的作用。 3．卵母細(xì)胞成熟率的

12、測(cè)定 以GVBD作為細(xì)胞核成熟的標(biāo)志，PBl作用細(xì)胞質(zhì)成熟的標(biāo)志。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 卵母細(xì)胞的成熟受多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，其中EGF和TNFα可直接作用于裸卵，分別對(duì)卵母細(xì)胞的成熟起促進(jìn)和抑制作用；ET-1對(duì)裸卵無(wú)明顯影響，但能呈劑量和時(shí)間依賴方式抑制復(fù)合卵母細(xì)胞的成熟；小劑量NO供體硝普鈉雖對(duì)復(fù)合卵母細(xì)胞的成熟無(wú)直接作用，但可反轉(zhuǎn)dbcAMP和一氧化氮合成酶抑制劑L-NAME對(duì)卵母細(xì)胞成熟的抑制作用，大劑量硝普鈉則抑制復(fù)合卵

13、母細(xì)胞的成熟。E<,2>和P對(duì)TNFα、ET-1和大劑量NO對(duì)卵母細(xì)胞的抑制作用具有保護(hù)效應(yīng)，且似乎E<,2>更偏重于預(yù)防性作用，而P更偏重于治療性作用。 第四部分 原癌基因在介導(dǎo)細(xì)胞因子影響 卵母細(xì)胞成熟中的作用 目的和方法 細(xì)胞因子調(diào)控卵母細(xì)胞成熟的機(jī)理尚不清楚。本研究探討：①原癌基因c-erbB<,2>、c-myb在卵母細(xì)胞成熟中的作用及在介導(dǎo)細(xì)胞因子調(diào)控卵母細(xì)胞成熟中的作用；②在調(diào)控卵母

14、細(xì)胞成熟中原癌基因在細(xì)胞因子和MAPK、MPF間是否起某種紐帶作用；③E<,2>或／和P對(duì)細(xì)胞因子影響卵母細(xì)胞成熟的保護(hù)性作用是否與原癌基因有關(guān)。 6.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 原癌基因c-erbB<,2>、C-myb在卵母細(xì)胞成熟中起著重要的作用，可能是調(diào)控卵母細(xì)胞成熟中關(guān)鍵的蛋白激酶如MAPK、MPF的上游激活物，是介導(dǎo)細(xì)胞因子和MAPK、MPF間調(diào)控卵母細(xì)胞成熟的中間信號(hào)物質(zhì)；雌二醇和孕酮對(duì)TNFα、ET-

15、1、NO等細(xì)胞因子抑制卵母細(xì)胞成熟的作用與逆轉(zhuǎn)卵母細(xì)胞中c-erbB<,2> mRNA、c-myb mRNA表達(dá)和MAPK磷酸化水平及cyclinB1含量下降有關(guān)。 全文總結(jié) 通過(guò)以上研究，我們得出如下結(jié)論： 1．小鼠處于動(dòng)情期和動(dòng)情后期其體內(nèi)分別含有高水平的E2和P，對(duì)內(nèi)毒素造成的肝、肺等組織的損害有保護(hù)性作用，保護(hù)性作用的機(jī)理可能與降低TNFα、NO或／和ET-1產(chǎn)生和升高EGF產(chǎn)生有關(guān)；內(nèi)毒素攻擊時(shí)也使卵巢

16、中EGF、TNFα、NO、ET-1等產(chǎn)生相應(yīng)的變化，尤其在動(dòng)情間期使EGF明顯下降，TNFα、NO和：ET-1明顯上升。 2．內(nèi)毒素能干擾小鼠的卵泡發(fā)育和排卵以及卵母細(xì)胞的成熟，此作用可能與抑制E<,2>和P產(chǎn)生有關(guān)；外源性E<,2>和P對(duì)內(nèi)毒素抑制卵巢的生殖功能具有保護(hù)性作用。 3.卵母細(xì)胞的成熟受多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，其中EGF和TNFα可直接作用于裸卵，分別對(duì)卵母細(xì)胞的成熟起促進(jìn)和抑制作用；ET-1對(duì)裸卵無(wú)明顯影響，

17、但能呈劑量和時(shí)間依賴方式抑制復(fù)合卵母細(xì)胞的成熟；小劑量NO供體硝普鈉雖對(duì)復(fù)合卵母細(xì)胞的成熟無(wú)直接作用，但可反轉(zhuǎn)dbcAMP和一氧化氮合成酶抑制劑L-NAME對(duì)卵母細(xì)胞成熟的抑制作用，大劑量硝普鈉則抑制復(fù)合卵母細(xì)胞的成熟。 4.用RT-PCR、western blot及顯微注射等多種方法證實(shí)，原癌基因c-erbB<,2>、c-myb在卵母細(xì)胞成熟中起著重要的作用，可能是調(diào)控卵母細(xì)胞成熟中關(guān)鍵的蛋白激酶如MAPK、MPF的上游激活物