甲氧基聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-聚乙烯亞胺納米復(fù)合物介導(dǎo)的CXCL10基因治療聯(lián)合放療抗子宮頸癌作用的體外實驗研究.pdf

1、目的:近年來，子宮頸癌的發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢，而放療在其治療中占據(jù)了舉足輕重的地位，但腫瘤的乏氧狀態(tài)等導(dǎo)致子宮頸癌細胞產(chǎn)生放療抵抗，放療療效亟待改善。數(shù)十年來，基因治療掀起熱潮，而研究證實CXC趨化因子配體10(CXCL10)具有誘導(dǎo)凋亡、抑制血管生成、抗HPV病毒等多種抗子宮頸癌作用，甚至可起到放療增敏的作用。非病毒載體如納米材料作為理想的基因載體，可以有效地將治療基因被動靶向于腫瘤細胞。因此設(shè)想采用一種納米材料載體負載CXCL10與放

2、療聯(lián)合，分別在體內(nèi)和體外探究其提高放療療效的作用，從而為形成結(jié)合放療和基因治療的子宮頸癌綜合治療新方法指明方向。
　　方法:本實驗采用低分子量PEI(1200Da)與mPEG-PCL(5000-2000Da)組裝成高分子聚合物mPEG-PCL-g-PEI。并采用Varian400型核磁共振儀和傅里葉紅外光譜儀對聚合物前體mPEG-PCL及該高分子聚合物mPEG-PCL-g-PEI的結(jié)構(gòu)進行表征，通過激光粒度儀和透射電子顯微鏡分別測

3、定mPEG-PCL-g-PEI及CXCL10-mPEG-PCL-g-PEI納米粒子的粒徑、電位與形貌。利用帶正電荷的納米粒和帶負電荷的質(zhì)粒之間的靜電引力，制備了綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA-mPEG-PCL-g-PEI，通過瓊脂糖凝膠電泳實驗探尋出納米粒負載質(zhì)粒DNA的最佳轉(zhuǎn)染比例，再在倒置熒光顯微鏡下觀察其轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白質(zhì)粒后表達綠色熒光蛋白的情況，接下來，用該納米粒負載CXCL10質(zhì)粒，采用PCR法擴增CXCL10目的基因片段，電泳驗證

4、轉(zhuǎn)染的成功。利用MTT法測定CXCL10/mPEG-PCL-g-PEI納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染的細胞放療后的相對細胞活性。
　　結(jié)果:傅里葉變換紅外光譜、1H-核磁共振光譜對mPEG-PCL前體聚合物及聚合物mPEG-PCL-g-PEI的結(jié)構(gòu)表征證明該兩親性嵌段聚合物成功合成，具有良好的水溶性，且能夠在水溶液中自組裝成為納米膠束結(jié)構(gòu)。瓊脂糖凝膠電泳表明納米粒負載質(zhì)粒DNA的最佳轉(zhuǎn)染比例為:48/1(w/w)。mPEG-PCL-g-PEI及C

5、XCL10-mPEG-PCL-g-PEI納米粒子(w/w:48/1)的透射電鏡圖表明兩種納米復(fù)合物均為球形。平均粒徑分別是20nm和46nm，電位分別為+21.76、+5.71mV。細胞毒性試驗表明，在低濃度范圍內(nèi)，該納米材料細胞毒性較小，具有生物相容性，隨著聚合物濃度的增加，細胞毒性越大(p＜0.05)。最佳轉(zhuǎn)染質(zhì)量比(w/w:48/1)下載綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA-mPEG-PCL-g-PEI對Hela細胞進行轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡成像證實

6、其轉(zhuǎn)染效率稍低于高分子量PEI25kD，但細胞毒性較小。PCR擴增目標片段CXCL10基因片段所在的強電泳條帶證實載CXCL10質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。MTT法初步證實CXCL10-mPEG-PCL-g-PEI納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染Hela細胞后成功表達，并在3Gy、6Gy、9Gy的相對細胞活性小于單純材料組和載空質(zhì)粒材料組。
　　結(jié)論:mPEG-PCL-g-PEI被成功合成，在低濃度范圍內(nèi)，細胞毒性較小，高濃度范圍細胞毒性與濃度呈正相關(guān)，且能自組