三種動物回腸總菌及乳酸菌對家兔隱窩和小鼠DCs炎性反應的影響.pdf

1、家兔腸道易受感染，進而導致嚴重的炎癥和隨后高的死亡率。腸道中的細菌包括各種共生菌代謝產(chǎn)物和菌體成分可以誘導腸道炎癥反應。研究證實革蘭氏陰性菌菌體比陽性菌菌體更容易引起炎癥。與豬和雞等單胃動物不同，采食后的家兔各腸段的主要菌門是革蘭氏陰性菌擬桿菌，且革蘭氏陽性菌乳酸菌在總菌中所占比例很低。本論文比較健康成年豬、雞和家兔回腸總菌對培養(yǎng)的家兔隱窩細胞及DC炎癥反應的誘導作用，并研究本實驗室已經(jīng)篩選的幾株兔源乳酸菌對腸道上皮中隱窩細胞和樹突狀細

2、胞的炎性調(diào)節(jié)作用，以探討家兔特有的腸道菌群是否會導致其腸道更易發(fā)生炎癥，以及乳酸菌是否可緩解炎性反應，且不同乳酸菌的緩解作用是否存在差異，兩種不同細胞類型對抗原的炎性反應的差異，為家兔篩選益生菌，提高仔兔免疫力和減少仔兔腸炎發(fā)生提供理論依據(jù)。主要的研究內(nèi)容及結果如下:
　　1.試驗一：從未飼喂抗菌素的健康6月齡關中黑豬、42日齡科寶肉雞和60日齡成年獺兔回腸中收集內(nèi)容物，每種動物3個個體的回腸內(nèi)容物等量混樣提取菌群基因組DNA，I

3、llumina HiSeq測序?qū)Ρ确治鲐i、雞和家兔回腸總菌組成。結果顯示，家兔回腸菌群第一優(yōu)勢菌門是擬桿菌門，占總菌群的百分比為89.32％;豬和雞回腸菌群最優(yōu)菌門是厚壁菌門，分別占80.79％和88.50％。三種動物回腸內(nèi)容物中乳桿菌屬豐度分別為19.19％、81.19％和0.72％。Beta多樣性指數(shù)顯示豬和雞回腸菌群組成接近，家兔與兩者差異較大。
　　2.試驗二：(1)對試驗一中豬、雞及家兔回腸總菌滅活后作用于培養(yǎng)的家兔隱窩

4、細胞，空白對照組添加PBS，熱滅活總菌處理隱窩6h后收集細胞，測定相關基因的表達。結果如下:與對照組相比，豬和雞回腸滅活總菌顯著提高家兔隱窩細胞的TLR2、TLR3和TLR4拘表達（P＜0.05）;家兔回腸總菌能顯著提高TLR4的表達(P＜0.01)。各處理組對TLR9均無顯著影響(P＞0.05)。三種總菌均顯著提高了促炎性因子TNF-α和IL-6的表達(P＜0.05)。雞回腸總菌對抗炎性因子IL-10的表達刺激作用比其他組顯著(P＜0

5、.05)，且豬和雞回腸總菌提高了IFN-β的表達(P＜0.05），豬回腸總菌比家兔回腸總菌有增加IL-10表達的趨勢（P＜0.1），但家兔回腸總菌對抗炎因子IL-10的表達沒有促進作用(P＞0.05)，甚至有降低IFN-β表達的趨勢（P＜0.1）。(2)用實驗室前期分離的兔源植物乳桿菌L.p2、干酪乳桿菌L.a1和屎腸球菌E.f2，以及購買的大腸桿菌E.coli K88滅活后對仔兔隱窩細胞進行刺激6h后收集細胞，測定相關基因的表達。結果

6、如下:三株乳酸菌顯著提高了TLR2、TLR3和IFN-β的表達(P＜0.05)。大腸桿菌E.coli K88顯著提高了TLR4表達(P＜0.05)。植物乳酸菌L.p2、屎腸球菌E.f2和大腸桿菌E.coli K88組均顯著提高隱窩細胞TNF-α的表達(P＜0.05)。各處理均顯著提高了IL-6的表達(P＜0..05)。植物乳桿菌L.p2和屎腸球菌E.f2顯著提高了IL-10的表達（P＜0.05），E.coli K88組IL10的表達顯著

7、低于對照組(P＜0.05)。三株乳酸菌中植物乳桿菌對促炎性因子的刺激作用更強。
　　3.試驗三：用豬、雞和家兔回腸總菌及兔源乳酸菌的滅活菌刺激小鼠骨髓源樹突狀細胞系DC2.4細胞，結果表明:(1)DC2.4細胞受到滅活L.p2刺激后，TLR2、TLR4、TNF-α和IL-10表達隨著刺激時間增加呈現(xiàn)先升高后降低的規(guī)律，在2h前后表達量較高。(2)豬、雞和家兔回腸總菌刺激DC2.4細胞2h后，豬和雞回腸菌比家兔回腸菌顯著提高TLR3

8、表達(P＜0.05)。豬和雞回腸菌顯著提高了TLR2和TLR4的表達(P＜0.05)，家兔回腸菌有提高TLR2的趨勢（P＜0.1），但對TLR3無顯著影響(P＞0.05)。各處理組對TLR9表達無顯著影響（P＞0.05），均顯著提高了TNF-α及IL-10的表達(P＜0.05），但家兔回腸總菌對TNF-α表達刺激作用顯著高于豬和雞回腸總菌。雞回腸總菌顯著提高了IL-6和IFN-β的表達(P＜0.05)，豬回腸總菌有提高IL-6和IFN-

9、β基因表達的趨勢(P＜0.1)，但是家兔回腸總菌對IFN-β的表達無明顯的影響(P＞0.05)和有提高IL-6基因表達的趨勢（P＜0.1）。(3)在乳酸菌刺激DC2.4細胞2h的試驗中，與對照組相比，L.p2、L.a1和E.f2顯著提高TLR2的表達(P＜0.05)。L.a1和E.f2顯著提高了TLR3的表達(P＜0.05)。E.coli K88顯著提高了TLR4和TNF-α的表達(P＜0.05)。L.p2和E.f2顯著提高了TNF-α

10、基因的表達(P＜0.05)。相比對照組，L.a1和E.f2有增加IFNβ的趨勢(P＜0.1)。E.f2和E.coli K88顯著提高了IL-1基因表達(P＜0.05)。
　　綜上所述，家兔回腸菌群第一優(yōu)勢菌門是擬桿菌門，豬和雞第一優(yōu)勢菌門為厚壁菌門，且家兔回腸乳酸菌遠遠低于豬和雞;與豬和雞回腸總菌相比，家兔回腸總菌更容易使隱窩和DC2.4細胞處于炎癥狀態(tài);滅活乳酸菌能夠引起細胞免疫反應中抗炎性和促炎性因子的同步表達，有利于維持機體