針對(duì)MTA1 mRNA的siRNA載體構(gòu)建及其對(duì)基因沉默作用.pdf

1、背景和目的 惡性腫瘤是臨床上深感棘手的難題，其致死的主要原因是腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多種基因及其產(chǎn)物的復(fù)雜過(guò)程，包括腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離，侵入血管、淋巴管，黏附內(nèi)皮細(xì)胞而停留在遠(yuǎn)隔部位，向外浸潤(rùn)，誘導(dǎo)新生血管形成，逃避宿主抗腫瘤反應(yīng)和在轉(zhuǎn)移部位生長(zhǎng)等過(guò)程。因此了解腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移所涉及的基因和基因產(chǎn)物是目前國(guó)內(nèi)外一項(xiàng)重要的研究課題。近年來(lái)已有很多關(guān)于腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究，以期尋找出安全有

2、效的治療惡性腫瘤的方案，延長(zhǎng)惡性腫瘤患者的生存期，改善其生活質(zhì)量。 腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(metastasis associated gene 1，MTA1)定位于染色體14q32.3，人MTA1基因編碼分子量為82KD，含715個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)MTAl。MTA1蛋白具有明顯的親水性，不屬于細(xì)胞表面蛋白或分泌蛋白。蛋白羧基末端富含脯氨酸，與SH3結(jié)合域完全配對(duì)。而SH3在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中參與蛋白和蛋白間相互作用，構(gòu)成細(xì)胞骨架組分，

3、并與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中與浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因有關(guān)。MTA1蛋白還具有9個(gè)蛋白激C(PKCs)、2個(gè)酪氨酸激酶(1Ks)、7個(gè)酪蛋白激酶11(CK Ⅱ)的磷酸化位點(diǎn)以及4個(gè)N<,2>糖基化位點(diǎn)。說(shuō)明MTA1蛋白可能在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中與其他一些維持細(xì)胞正常功能的蛋白發(fā)生作用。運(yùn)用Southern blotting分析發(fā)現(xiàn)，MTA1基因在進(jìn)化當(dāng)中高度保守。MTA1被認(rèn)為是細(xì)胞核小體重構(gòu)和脫乙?；鶑?fù)合物(nucleosome remodeling a

4、nd histone eacetylase，NuRD)的組成部分之一，NuRD具有核小體重構(gòu)與組蛋白脫乙酰酶活性。組蛋白乙?；苓x擇性的使某些染色質(zhì)區(qū)域的結(jié)構(gòu)由緊密變得松散，開(kāi)放某些基因的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)其表達(dá)水平，ATP依賴的NuRD的乙?；c脫乙酰化代表了胞核結(jié)構(gòu)與功能調(diào)整的一般機(jī)制。它們通過(guò)影響染色質(zhì)的狀態(tài)來(lái)調(diào)整轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程，調(diào)控組蛋白脫乙?；鶑亩l(fā)揮其生物學(xué)作用。 目前多數(shù)研究認(rèn)為MTA1的高表達(dá)與一些上皮源性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密

5、切相關(guān)。MTA1可能是通過(guò)參與信號(hào)傳導(dǎo)與基因表達(dá)調(diào)控一系列有關(guān)浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的蛋白而起重要作用。MTA1基因的作用將為惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控提供一個(gè)有效的作用靶點(diǎn)和控制手段。近幾年來(lái)興起的RNA干擾技術(shù)，為腫瘤的分子生物治療開(kāi)辟了新的途徑。與傳統(tǒng)基因沉默技術(shù)相比，具有效果強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)，目前這一技術(shù)已在腫瘤的基因治療方面顯示出誘人的前景。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建針對(duì)MTA1 mRNA的siRNA重組載體，將siRNA對(duì)應(yīng)的DNA發(fā)卡樣雙鏈序列克隆入

6、載體內(nèi)，位于H1啟動(dòng)子下游，轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)MTAl靶向的siRNA分子，特異性沉默MTA1的表達(dá)。 方法 依據(jù)GenBank中MTA1基因(NM_004689)的序列，利用以下幾個(gè)網(wǎng)址提供的設(shè)計(jì)分析軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)http：//www．a(chǎn)mbion．com/techlib/ misc/siRNA design．html： http：//www2．takara-bio．co．jp/sima-d/top．php。

7、對(duì)上述候選序列通過(guò)美國(guó)生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)的在線同源序列檢索http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/Blast，確定針對(duì)MTAl的siRNA序列。合成MTA1發(fā)卡樣siRNA寡核苷酸，退火成雙鏈DNA，克隆入T載體，利用α互補(bǔ)和T7/SP6 PCR擴(kuò)增篩選鑒定重組子pGEM-T-MTA1；用BgllI和HindⅢ雙酶切重組子pGEM

8、-T-MTA1和siRNA表達(dá)載體pSupemeo；將雙粘MTA1發(fā)卡樣siRNA片段亞克隆入siRNA表達(dá)載體PSuperneo中；利用BglⅡ和HindⅢ雙酶切篩選鑒定重組子pSupemeo-MTA1；對(duì)插入序列進(jìn)行DNA序列分析。將siRNA表達(dá)載體pSupemeo-MTA1轉(zhuǎn)入人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63中，用RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞MTA1 mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果 1．得到116個(gè)候選MTA1 siRNA靶區(qū)段，

9、對(duì)上述候選序列通過(guò)美國(guó)生物技術(shù)信息中心的在線同源序列檢索，最后確定的編碼序列是19個(gè)堿基，GACCCTGCTGGCAGATAAA(即481-499nt)。 2．siRNA發(fā)卡DNA的退火后，電泳可見(jiàn)明亮條帶，位于約70bp處，與設(shè)計(jì)完全一致。 3．退火產(chǎn)物與pGEM-T Easy連接后，轉(zhuǎn)化JM109，篩選鑒定后得到重組子pGEM-T-MTA1。 4．亞克隆后，用BglⅡ和HindⅢ雙酶切對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，得到

10、pSupernco-MTA1。 5．對(duì)重組子pSupemeo-MTA1插入片段DNA序列測(cè)序，結(jié)果與設(shè)計(jì)完全一致。 針對(duì)WTAl mRNA的siRNA載體構(gòu)建及其對(duì)基因沉默作用 6．轉(zhuǎn)染pSuperneo-MTAl的實(shí)驗(yàn)組骨肉瘤細(xì)胞中MTAl mRNA表達(dá)幾乎完全被抑制，而兩個(gè)對(duì)照組(無(wú)關(guān)siRNA對(duì)照組和空載體對(duì)照組)和未轉(zhuǎn)染的骨肉瘤細(xì)胞系MG-63細(xì)胞中都存在較高水平的MTAl mRNA表達(dá)。 結(jié)論