化學(xué)去細(xì)胞同種異體神經(jīng)支架移植后再血管化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf_第1頁(yè)
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1、【目的】 各種原因引起周圍神經(jīng)完全斷裂后,神經(jīng)斷端間的神經(jīng)束匹配及無(wú)張力縫合通常為神經(jīng)再生提供了最佳的局部環(huán)境<'[1]>。但是,治療延遲或長(zhǎng)段神經(jīng)組織缺損而無(wú)法進(jìn)行直接縫合的時(shí)候,需要某種移植替代物來(lái)達(dá)到神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能重建的目的。雖然人們研究和發(fā)展了各種周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)材料,包括自體神經(jīng)、神經(jīng)組織來(lái)源及非神經(jīng)組織來(lái)源的移植替代物,但是真正應(yīng)用于臨床并取得較好治療效果的只有自體神經(jīng)移植,其余主要存在于實(shí)驗(yàn)階段。組織工程

2、化周圍神經(jīng)的出現(xiàn)拓寬了周圍神經(jīng)缺損治療中移植替代物的選擇范圍,具有廣闊的發(fā)展前景。 從治療方面的選擇來(lái)看,組織工程化周圍神經(jīng)的最終目的是通過(guò)生物材料支架、種子細(xì)胞、生物活性分子的結(jié)合,構(gòu)建功能性三維復(fù)合物來(lái)替代、恢復(fù)由創(chuàng)傷或病理過(guò)程所導(dǎo)致周圍神經(jīng)缺損的解剖結(jié)構(gòu)和功能。作為一種有機(jī)的統(tǒng)一整體,組織工程化周圍神經(jīng)促進(jìn)神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的活性主要依賴于種子細(xì)胞的生物學(xué)行為。對(duì)于體外構(gòu)建后尚無(wú)內(nèi)在血供系統(tǒng)(例如可以與宿主脈管結(jié)構(gòu)相連接的

3、毛細(xì)血管床)的工程化神經(jīng)移植物來(lái)說(shuō),種子細(xì)胞的生存、增殖、遷移、功能發(fā)揮等特性在最初可以通過(guò)有限的物質(zhì)擴(kuò)散來(lái)維持,但是以后主要依靠植入后與宿主機(jī)體組織緊密結(jié)合而由周圍毛細(xì)血管長(zhǎng)入,即發(fā)生再血管化的進(jìn)程直接決定。在已經(jīng)開(kāi)始臨床應(yīng)用的組織工程化產(chǎn)品中,人工軟骨是無(wú)血管組織<'[2]>,而人工皮膚的厚度允許其能夠從周圍的移植床獲得血供<'[3]>。人工膀胱<'[4]>和人工心臟瓣膜<'[5]>可以成功進(jìn)入臨床的部分原因也是兩者都在血供建立之前

4、能夠通過(guò)物質(zhì)擴(kuò)散得到足夠的營(yíng)養(yǎng)。因此,組織工程周圍神經(jīng)及時(shí)和充分地再血管化最終影響了所修復(fù)神經(jīng)的再生和功能恢復(fù),仍然是其能否實(shí)現(xiàn)臨床實(shí)際應(yīng)用的限制因素。 周圍神經(jīng)組織工程支架及其再血管化后形成的血管結(jié)構(gòu)是移植體與宿主組織發(fā)生聯(lián)系的重要途徑。支架在體內(nèi)必須及時(shí)完成再血管化以形成具有活性的微血管,以維持種子細(xì)胞的生存、表型、生物學(xué)功能及支持神經(jīng)再生,成為選擇理想支架材料和成功構(gòu)建組織工程化周圍神經(jīng)的過(guò)程中必須要考慮的重要問(wèn)題。目前,

5、人工合成材料已經(jīng)廣泛應(yīng)用于組織工程化周圍神經(jīng)支架的研究中,但是本身固有的多種缺陷使其尚不能進(jìn)一步在臨床得到應(yīng)用?;瘜W(xué)方法處理同種異體周圍神經(jīng),減弱或消除免疫原性后制備形成的生物活性支架,屬于天然細(xì)胞外基質(zhì)類生物衍生材料,具有良好的生物相容性、生物降解性和生物力學(xué)性能;種植的活性雪旺細(xì)胞能夠在存留的基底膜管中遷移形成細(xì)胞帶<'[6]>為早期的再生軸突提供支持;移植后很快與受體組織發(fā)生反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞及新生成的膠原沉積,促進(jìn)移植物的快速血管化

6、(血管化是組織功能恢復(fù)所必需的),這些獨(dú)特性質(zhì)使它成為一種很有實(shí)用意義的組織工程支架材料。 本實(shí)驗(yàn)室在前面的研究中已經(jīng)證實(shí):(1).化學(xué)萃取同種異體神經(jīng)制備的去細(xì)胞生物衍生支架符合組織工程支架材料的基本要求,可以用做細(xì)胞的遞送載體;(2).該種神經(jīng)組織工程支架與種子細(xì)胞(雪旺細(xì)胞或骨髓基質(zhì)細(xì)胞)體外復(fù)合后可以成功修復(fù)周圍神經(jīng)缺損。但是,我們尚未對(duì)去細(xì)胞生物衍生支架體內(nèi)移植后新血管形成,即發(fā)生再血管化的過(guò)程,包括形式和時(shí)間,進(jìn)行研

7、究,而且目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于此方面的研究較少,相關(guān)報(bào)道也僅僅是粗略涉及??紤]到臨床治療過(guò)程中,神經(jīng)修復(fù)部位(神經(jīng)床)的微循環(huán)情況非常復(fù)雜,這個(gè)問(wèn)題的解決更是顯得尤為重要。 鑒于此,本實(shí)驗(yàn)用化學(xué)方法萃取大鼠同種異體坐骨神經(jīng)來(lái)制備去細(xì)胞生物衍生支架,并從形態(tài)、結(jié)構(gòu)、體內(nèi)移植后發(fā)生再血管化的時(shí)間和形式等方面證實(shí)其能夠成為周圍神經(jīng)的組織工程化支架,為組織工程化周圍神經(jīng)產(chǎn)品的研制、開(kāi)發(fā)及臨床研究提供了理論支持。 【方法】 1.大

8、鼠同種異體去細(xì)胞神經(jīng)支架的制備:利用化學(xué)試劑Triton-X-100和脫氧膽酸鈉溶液處理大鼠坐骨神經(jīng),以去除掉其中的細(xì)胞成分和髓鞘結(jié)構(gòu),化學(xué)萃取后的同種異體神經(jīng)放于PBS液中4℃保存?zhèn)溆??;瘜W(xué)萃取后的同種異體神經(jīng)分別行HE染色、纖維素染色、砂羅鉻花青染色,并行透射電鏡觀察,了解支架的大體結(jié)構(gòu)及有無(wú)細(xì)胞成分和髓鞘存留。 2.大鼠同種異體去細(xì)胞神經(jīng)支架體內(nèi)移植后的再血管化檢測(cè):自梨狀肌下緣以遠(yuǎn)0.5cm處向遠(yuǎn)側(cè)截取部分坐骨神經(jīng),造成周

9、圍神經(jīng)缺損。分別用自體神經(jīng)和化學(xué)去細(xì)胞同種異體神經(jīng)支架修復(fù),術(shù)后于5天、7天、10天、14天、21天、28天、2月和3月取材,同時(shí)截取對(duì)側(cè)正常坐骨神經(jīng)相同部位的標(biāo)本,行縱行冷凍切片的堿性磷酸酶組織化學(xué)染色,觀察和比較移植物在不同時(shí)間段的新生微血管形成情況。 【結(jié)果】 1.化學(xué)去細(xì)胞神經(jīng)支架的檢測(cè):利用Triton-x-100和脫氧膽酸鈉萃取大鼠同種異體坐骨神經(jīng)1次后,病理學(xué)HE染色和砂羅鉻花青染色觀察證實(shí)神經(jīng)中的細(xì)胞成分

10、和髓鞘結(jié)構(gòu)消失,纖維素染色和透射電鏡結(jié)果顯示雪旺細(xì)胞基底膜和其他細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)存留,化學(xué)萃取2次后的同種異體神經(jīng)存留結(jié)構(gòu)較化學(xué)萃取1次后的散亂. 2.化學(xué)去細(xì)胞神經(jīng)支架移植后的再血管化:化學(xué)去細(xì)胞大鼠同種異體神經(jīng)支架移植修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損后,堿性磷酸酶組織化學(xué)染色顯示不同時(shí)間段的移植物內(nèi)新生微血管長(zhǎng)入情況,結(jié)果顯示術(shù)后第7天支架開(kāi)始再血管化,第21天完全再血管化。與其比較,大鼠坐骨神經(jīng)缺損自體移植修復(fù)后,第5天移植物開(kāi)始再血管

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