犬同種異體椎間盤移植的動物實驗研究.pdf

1、背景：
　　椎間盤退變引起的下腰痛(Low Back Pain LBP)已經(jīng)成為影響人類正常生活最主要的職業(yè)性疾病之一。近年來，許多國家報道每年用于該類疾病的治療及預(yù)防的經(jīng)費已經(jīng)對其造成了巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，因此針對椎間盤退變的研究具有十分重要的意義。
　　椎間盤退變有許多病理學(xué)表現(xiàn)，如髓核組織水分丟失、纖維環(huán)變性破裂，終板損傷等。目前的主要研究認(rèn)為椎間盤退變的最終途徑是營養(yǎng)通道的缺失，而椎間盤內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)幾乎都來自于終板血管的

2、彌散作用。目前關(guān)于基因、細(xì)胞等治療方式的研究主要著重于修復(fù)退變的髓核組織，且主要適用于早、中期退變的患者，并未針對主要影響椎間盤營養(yǎng)彌散功能的終板進(jìn)行研究。近50年來，同種異體椎間盤移植技術(shù)作為一種新的治療方法，已在部分動物實驗和臨床治療中開展，且取得了良好的療效。然而，對于移植術(shù)后椎間盤營養(yǎng)功能的變化情況目前仍不清楚。
　　動態(tài)對比增強核磁共振(Dynamic Contrast-enhanced Magnetic Resonan

3、ceImaging，DCE-MRI)在增強造影劑的輔助下可以獲得組織的灌注及血流情況，目前已在各個器官良惡性腫瘤的鑒別得到廣泛應(yīng)用。近期一些動物及人體試驗中也證明了其在觀察椎間盤彌散功能狀態(tài)的有效性及可行性。
　　目的：
　　1.通過建立犬同種異體椎間盤模型，研究并描述一種在無內(nèi)固定輔助條件下建立犬同種異體椎間盤移植模型的手術(shù)技術(shù)。
　　2.利用DCE-MRI技術(shù)及病理學(xué)觀察對移植術(shù)后動物進(jìn)行隨訪，觀察移植椎間盤內(nèi)彌散

4、功能狀態(tài)的動態(tài)變化，探討其生物功能的變化情況。
　　方法:
　　1.選取1歲齡健康雜種犬25只，(10-15月齡，10-14kg)，雌雄不限，進(jìn)行X線及MRI對椎間盤整體情況進(jìn)行評價，通過Pfirrmann分級篩選出無明顯脊柱畸形，椎間盤整體情況良好的動物作為實驗對象。
　　2.注射過量戊巴比妥鈉處死其中的5只犬，在無菌條件下取L1-L6椎間盤共25個放入預(yù)先配置好的凍存液中，逐級凍存，步驟為4℃(12h)、-20℃(

5、2h)、-40℃(2h)、-80℃(2h)，最后放入液氮中保存。剩余20只犬用于建立L5-L6椎間盤移植模型的研究。
　　3.術(shù)前、術(shù)后1、4、6、8、12周進(jìn)行腰椎正側(cè)位X線檢查，觀察移植椎間盤的位置以及與相鄰椎體的愈合情況，測量術(shù)后各時間點椎間盤高度數(shù)值，以(x)±s表示，并采用方差分析(ANOVA)分別與術(shù)前測量的椎間盤高度進(jìn)行對比。以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　4.術(shù)后4、8、12、24周對移植成功的動物進(jìn)行D

6、CE-MRI觀察，每次掃描的時間點為靜脈注射造影劑(0.3mmol/kg)后0 min，2 min、5 min、10min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min，掃描序列為T1FSE，3.0T。選取椎間隙上下椎體、上下終板區(qū)域及髓核五個區(qū)域的感興趣區(qū)間，對感興趣的間隔不同時間點測量感興趣區(qū)域(Region Of Interest ROI)的信號強度值，并

7、計算增強率。根據(jù)結(jié)果繪制各感興趣區(qū)間的時間-信號增強率曲線，觀察各曲線的變化特點，并對其進(jìn)行分析。
　　5.術(shù)后12周、24周處死半數(shù)實驗動物，獲得移植節(jié)段椎間盤及上下約5mm的椎體骨性結(jié)構(gòu)，放入4％的多聚甲醛中固定2周，然后放入配制好的Perenyi's脫鈣液中脫鈣4周，最后進(jìn)行石蠟包埋，切片后行H&E染色及Masson染色，觀察椎間盤內(nèi)髓核、終板及纖維環(huán)的形態(tài)結(jié)構(gòu)等。
　　結(jié)果：
　　1.椎間盤移植手術(shù)前選取合適大

8、小的供體椎間盤，術(shù)中注意保留前、后縱韌帶及對側(cè)纖維環(huán)，可以實現(xiàn)在無內(nèi)固定條件下成功建立同種異體椎間盤移植模型。本研究中椎間盤移植成功17例，其余2例出現(xiàn)椎間盤脫出，1例出現(xiàn)椎間盤炎。
　　2.術(shù)后3月影像學(xué)檢查示移植椎間盤的上下終板與相鄰椎體形成骨性愈合，未出現(xiàn)移位及脫出。影像學(xué)測量移植術(shù)前椎間盤高度為:3.0±0.7mm，術(shù)后1、4、6、8、12周椎間盤高度分別為:2.9±0.3mm、2.7±0.6mm、2.7±0.4mm、2.

9、6±0.8mm、2.6±0.7mm;椎間盤高度的每個時間點平均值均低于術(shù)前，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，隨著觀察時間的增加，椎間盤的高度略有下降趨勢，但各組間椎間盤高度平均值無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3.大體標(biāo)本觀察發(fā)現(xiàn)，可見術(shù)后12周時移植椎間盤與椎體已形成骨性愈合，愈合區(qū)域仍可辨認(rèn)，局部無明顯免疫炎癥反應(yīng)表現(xiàn)。術(shù)后12周及24周的移植椎間盤與對照組相比均發(fā)生了一定程度的退變，椎間盤高度降低，髓核組織部分變

10、性，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)與髓核組織分界不清，纖維環(huán)同心圓排列結(jié)構(gòu)清楚，部分存在缺損，但兩個實驗組間無明顯差別。
　　4.病理學(xué)觀察中，與對照組相比，術(shù)后12周時髓核組織結(jié)構(gòu)松散，排列紊亂;內(nèi)層纖維環(huán)部分?jǐn)嗔眩篌w結(jié)構(gòu)仍較完整;軟骨終板增厚。術(shù)后24周時纖維環(huán)結(jié)構(gòu)紊亂，髓核組織部分纖維化，軟骨終板無明顯退變。
　　5.術(shù)后4、8、12、24周各感興趣區(qū)間時間-信號增強率曲線中，正常終板、髓核及椎體均出現(xiàn)兩個峰值，之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜

11、0.05)。術(shù)后4周移植椎間盤終板及髓核的分別于90 min和120 min達(dá)到峰值后出現(xiàn)波動，未觀察到第二峰值出現(xiàn)，增強速率及增強率最大值均低于對照組。術(shù)后8周移植椎間盤終板及髓核的均于120 min達(dá)到峰值后出現(xiàn)波動，未觀察到第二峰值出現(xiàn)，其增強速率及增強率最大值均低于對照組。術(shù)后12周各感興趣區(qū)間時間-信號增強率曲線中，移植椎間盤終板、髓核信號增強率均在120 min時達(dá)到峰值，然后開始緩慢下降，未出現(xiàn)第二個峰值，增強速率及增強率

12、最大值較前提高但仍均低于對照組。術(shù)后24周各感興趣區(qū)間時間-信號增強率曲線中，移植椎間盤終板、髓核信號強度分別在30 min及90 min時達(dá)到峰值后逐漸下降，均在150 min時再次開始增高，210 min時達(dá)到第二個峰值，兩個峰值之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.術(shù)前通過腰椎橫突進(jìn)行體表定位，可以保證手術(shù)節(jié)段的準(zhǔn)確性。采用恰當(dāng)?shù)氖中g(shù)技術(shù)，有助于在無內(nèi)固定輔助下成功實施同種異體椎間盤移植手術(shù)。選擇合

13、適大小的供體椎間盤，有利于提高手術(shù)成功率及降低術(shù)后移植椎間盤移位及脫出風(fēng)險。本研究提供了一種建立犬同種異體椎間盤移植模型的可行的手術(shù)方案。
　　2.術(shù)后4、8周實驗組DCE-MRI觀察提示椎間盤彌散功能受到了一定的影響，主要原因考慮是移植間盤與宿主椎體未形成骨性愈合，椎體與終板之間的血管襻網(wǎng)未完全吻合，造影劑到達(dá)終板時間延長，同時由于椎間盤代謝速率下降，導(dǎo)致240 min內(nèi)未觀察到第二峰值出現(xiàn)。
　　3.術(shù)后12周實驗組DC

14、E-MRI觀察提示椎間盤彌散功能與之前相比得到了一定的恢復(fù)，但與正常椎間盤仍有區(qū)別，主要原因考慮是移植椎間盤與椎體形成了骨性愈合，終板與椎體之間的血管網(wǎng)完成了重建，因此造影劑到達(dá)終板的速度較前加快，但由于手術(shù)造成前期椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)障礙，導(dǎo)致髓核細(xì)胞活性降低及細(xì)胞外基質(zhì)減少，對其代謝功能造成了一定影響，故仍未觀察到第二峰值出現(xiàn)。
　　4.術(shù)后24周實驗組DCE-MRI觀察提示移植椎間盤的終板功能已接近正常，盡管終板及髓核增強率最大值

15、仍小于對照組，但均可在210 min時觀察到第二峰值出現(xiàn)，說明移植手術(shù)未造成終板結(jié)構(gòu)破裂缺損情況。盡管移植手術(shù)對早期椎間盤彌散功能存在一定影響，并會降低髓核細(xì)胞活性，但在沒有損害終板的前提下，椎間盤的彌散功能可以得到基本的恢復(fù)。
　　總的來說，同種異體椎間盤移植技術(shù)作為治療椎間盤退行性疾病的方法，可以在一定程度上恢復(fù)椎間盤的穩(wěn)定性、活動度及生物活性。通過動態(tài)對比增強核磁共振對術(shù)后的觀察隨訪中發(fā)現(xiàn)，早期椎間盤內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的彌散功能受到