前列腺癌相關(guān)基因PC-1功能研究及其調(diào)控通路初探.pdf

1、PC-1基因是周建光研究員發(fā)現(xiàn)并克隆的新基因，該基因在雄激素非依賴、可轉(zhuǎn)移的前列腺癌晚期細胞系C4-2中高表達，而在雄激素依賴、不轉(zhuǎn)移的前列腺癌早期細胞系LNCaP中低表達。PC-1屬于癌蛋白TPD52家族，編碼一個包含224個氨基酸的蛋白分子，C端180個氨基酸與D52家族蛋白序列高度同源的，N端46個氨基酸是其特異的區(qū)域。TPD52家族成員在多種類型腫瘤中高表達，基因表達與細胞的增殖和惡變相關(guān)。不同于TPD52家族成員，PC-1基因

2、表達受雄激素正調(diào)控，主要在前列腺組織中表達。前期的研究發(fā)現(xiàn)PC-1基因定位于染色體8q21.1區(qū)域，該區(qū)域在前列腺癌組織標本中普遍擴增。利用前列腺癌的臨床組織樣本做免疫組化試驗表明PC-1基因在前列腺癌和前列腺內(nèi)皮增生(PIN)的樣本中的表達普遍較正常前列腺樣本中低。將PC-1基因在小鼠成纖維NIH3T3細胞中穩(wěn)定性高表達的結(jié)果顯示，該基因可使永生化的NIH3T3細胞向惡性腫瘤細胞轉(zhuǎn)化。前期的研究提示PC-1基因可能作為癌基因特異性的在

3、前列腺癌中起作用。 本研究首先建立穩(wěn)定高表達PC-1基因的細胞株C4-2B-PC-1及其對照細胞株C4-2B-neo。以這兩個細胞株為基礎(chǔ)，利用MTT實驗、軟瓊脂集落形成實驗，同時用RT-PCR和Real time PCR檢測了基因表達譜的變化，探討PC-1基因在C4-2B細胞中的功能。我們發(fā)現(xiàn)PC-1基因高表達之后引起了C4-2B細胞的增殖和惡性程度的提高，在撤除雄激素的條件下促進C4-2B細胞生長，并能導致一系列生長分化基因

4、表達的改變。為了研究PC-1基因發(fā)揮功能的分子機制，我們進一步研究了LNCaP-PC-1和對照細胞中受PC-1基因表達所調(diào)控的基因，重點研究了受體酪氨酸蛋白激酶(RTK)信號通路成員EphA3和SGEF/CSGEF。通過一系列實驗探討了這兩個分子的功能，嘗試著去解釋PC-1基因發(fā)揮功能的方式，其參與的信號的通路，或者受其調(diào)控的通路。我們的結(jié)果證明EphA3和SGEF/CSGEF能夠發(fā)生相互作用，而EphA3和SGEF/CSGEF是PC-

5、1基因的應(yīng)答分子，提示PC-1基因可能通過調(diào)控RTK信號通路來影響前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。利用GST pull down實驗，免疫共沉淀實驗Co-IP實驗發(fā)現(xiàn)SGEF與雄激素受體AR能夠在體內(nèi)體外相互作用。進一步利用GST pull down實驗和哺乳動物雙雜交實驗確定與AR發(fā)生相互作用的區(qū)域是SGEF的PH domain，而與SGEF發(fā)生相互作用的是AR的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域LBD。另外獨立的研究證明PC-1能夠與AR發(fā)生相互作用，由雄激素激活

6、的雄激素受體信號通路在前列腺的分化、維持和前列腺癌的發(fā)展中起到重要的作用，而我們的研究提示PC-1基因參與的RTK信號通路與雄激素受體信號通路之間存在著某種聯(lián)系，同時也說明PC-1基因參與的調(diào)控體系是一個復雜的的網(wǎng)絡(luò)。為研究SGEF/CSGEF在前列腺癌中的功能，我們制備了其兔多克隆抗體。得到了特異性較好，效價較高的兔抗血清。為了研究與AR相互作用的SGEF對雄激素受體的轉(zhuǎn)錄激活活性的影響。我們進一步在LNCaP細胞的瞬時轉(zhuǎn)染體系中利用