乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌中乙肝病毒BCP區(qū)A1762T-G1764A雙突變對X蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建乙型肝炎病毒(HBV)核心啟動子區(qū)(BCP)1762/1764雙突變株的重組質(zhì)粒。檢測HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌(HCC)病人肝癌組織中BCP區(qū)A1762T/G1764A雙突變和乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的表達(dá)，分析此雙突變對HBx表達(dá)的影響，探討其對HCC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及意義。
　　方法：(1)利用已有1.5拷貝HBV野生型全基因組序列質(zhì)粒（pHBV1.5，C型）為模板，采用分子克隆、大引物定點(diǎn)突變方法構(gòu)建BCP區(qū)A17

2、62T/G1764A雙突變重組質(zhì)粒。(2)將野生株重組質(zhì)粒和雙突變重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到HepG2.0細(xì)胞，測定其細(xì)胞培養(yǎng)液乙肝表面抗原(HBsAg)水平來確定雙突變質(zhì)粒的蛋白表達(dá)能力。(3)以野生株重組質(zhì)粒和雙突變重組質(zhì)粒基因序列設(shè)計(jì)特異性TaqMan MGB探針。(4)采用特異性探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR(PSRT-PCR)方法準(zhǔn)確檢測樣本雙突變。(5)采用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western-blot)檢測重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的HepG2.0細(xì)胞和

3、乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者肝癌組織的HBx表達(dá)。(6)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法。
　　結(jié)果：(1)成功構(gòu)建BCP區(qū)A1762T/G1764A雙突變重組質(zhì)粒。(2)成功制作用于同時(shí)檢測HBV DNA和雙突變拷貝量的TaqMan MGB探針。(3)成功使用PSRT-PCR方法快速、特異、準(zhǔn)確檢測乙肝病毒HBV BCP區(qū)A1762T/G1764A雙

4、突變。(4)體外實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染具有BCP區(qū)A1762T/G1764A雙突變重組質(zhì)粒的HepG2.0-M細(xì)胞株HBx表達(dá)水平高于轉(zhuǎn)染野生型重組質(zhì)粒的HepG2.0-W細(xì)胞株[86.67％(26/30) vs36.67％(11/30)，x2=15.864，p＜0.001]。(5)臨床實(shí)驗(yàn)顯示，具有BCP區(qū)A1762T/G1764A雙突變的肝癌細(xì)胞HBx表達(dá)水平高于無此雙突變的肝癌細(xì)胞[65.31％(32/49) vs36.84％(7/19)