中國(guó)漢族人RhD陰性表型的分子機(jī)理研究.pdf

1、Rh血型系統(tǒng)是人類血型中最具多態(tài)性和免疫遺傳特性的一個(gè)系統(tǒng)，迄今已發(fā)現(xiàn)含有49個(gè)獨(dú)立的抗原，是輸血醫(yī)學(xué)中除ABO血型之外最具臨床意義的一個(gè)血型系統(tǒng)。RhD抗原的高免疫原性常常會(huì)引起胎兒和新生兒溶血病(HDFN)、溶血性輸血反應(yīng)和自身免疫性溶血性貧血等疾病。自上世紀(jì)90年代編碼2個(gè)Rh蛋白的基因RHD和RHCE被克隆以來(lái)，人們對(duì)Rh血型系統(tǒng)的分子機(jī)理已獲得相當(dāng)多的認(rèn)識(shí)。近年來(lái)對(duì)RhD抗原和RHD基因的免疫學(xué)及分子生物學(xué)研究已成為國(guó)際上的熱

2、點(diǎn)并取得重要進(jìn)展。2000年，研究人員發(fā)現(xiàn)RHD基因兩側(cè)各有一段Rh盒子(R}lestJs boxes)基因，其序列的高度同源性引發(fā)了RHD基因的缺失并形成融合基因，這是人類第一次構(gòu)思和闡明RhD陰性表型形成的分子機(jī)制。對(duì)RhD抗原和眾多D變種(迄今已發(fā)現(xiàn)40種弱D型和25種部分D型)的研究表朗RhD的血清學(xué)表型存在復(fù)雜的分子機(jī)制，包括單核苷酸多態(tài)性(SNPs)、基因缺失和插入、基因互換和重組、基因轉(zhuǎn)換等。在Rh血型分子機(jī)制逐漸闡明之后

3、，以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)分析已應(yīng)用于臨床，其中RHD基因定型和在孕婦血漿中檢測(cè)胎兒RHD基因等技術(shù)最具臨床價(jià)值。另外，分析孕婦丈夫RHD基因的純合性可預(yù)測(cè)胎兒患HDFN的幾率，應(yīng)用基因定型可解決獻(xiàn)血者的疑難血型鑒定、反復(fù)大量輸血或近期輸血病人的血型鑒定、D變種(弱D、部分D型)的鑒定等血型血清學(xué)中的疑難問(wèn)題。 然而對(duì)RHD基因的研究顯示其存在明顯的種族差異，以高加索人基因結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的基因定型等臨床應(yīng)用在其他民族中存在局限性。

4、在非洲人RhD陰性個(gè)體中普遍存在RHDΨ基因和RHD-CE-D<'s>基因，從而造成RHD基因定型的假陽(yáng)性。亞洲人中存在一種稱為Del型的弱D型個(gè)體，該型在日本人或中國(guó)人RhD陰性個(gè)體中所占比例為10-33﹪。Del型個(gè)體存在幾乎完整的RHD基因，其弱D抗原只能通過(guò)繁瑣耗時(shí)的吸收放散實(shí)驗(yàn)才可檢測(cè)出來(lái)。另外在亞洲人RhD陰性個(gè)體中還存在一定比例的RHD-CE-D雜化基因及少量基因突變。對(duì)亞洲人(包括中國(guó)人)RHD基因的研究遠(yuǎn)滯后于對(duì)高加索

5、人的研究，關(guān)于Del型的分子機(jī)制和免疫機(jī)制、D-CE-D雜化基因、弱D型和部分D型、Rh盒子基因序列等分子機(jī)理仍未清楚，因而無(wú)法準(zhǔn)確可靠地將基因定型技術(shù)應(yīng)用于臨床。本研究在以往研究的基礎(chǔ)上，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、多重PCR、PCR-RFLP、DNA序列分析等先進(jìn)技術(shù)對(duì)中國(guó)漢族人RhD陰性RHD基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)性的分子生物學(xué)分析和研究，以建立中國(guó)人RHD基因結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫(kù)并將以此為基礎(chǔ)將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于新生兒溶血病產(chǎn)前診斷、疑難血型的

6、基因定型等臨床醫(yī)學(xué)中。 [目的]： 研究和分析中國(guó)漢族人RhD陰性表型個(gè)體、RhD陽(yáng)性表型個(gè)體和部分D表型的RHD及Rh盒子基因的結(jié)構(gòu)，以闡明中國(guó)漢族人群RhD陰性表型形成的分子機(jī)理，并對(duì)Rh盒子基因的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析以確定RHD基因的純合性，建立中國(guó)人RHD基因結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫(kù)并以此為基礎(chǔ)將基因定型技術(shù)應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)中。 [方法]： 1．首先對(duì)大量獻(xiàn)血者樣本采用標(biāo)準(zhǔn)血清學(xué)方法進(jìn)行RhD抗原鑒定。對(duì)所有RhD

7、抗原初篩陰性樣本，采用間接抗人球蛋白方法和吸收放散試驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)D抗原，以排除或確認(rèn)弱D型、De1型或部分D表型.對(duì)RhD陰性樣本進(jìn)行RhCcEe表型的血清學(xué)和分子生物學(xué)分型。 2．選擇176例RhD陰性標(biāo)本、11例RhD陽(yáng)性標(biāo)本和8例部分D標(biāo)本，采用3種進(jìn)口DNA提取試劑盒，提取其基因組DNA。所選擇樣本均系中國(guó)漢族人，無(wú)親緣關(guān)系。 3．對(duì)65例RhD陰性標(biāo)本和11例RhD陽(yáng)性標(biāo)本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realti

8、me quantitative PCR，RQ-PCR)技術(shù)檢測(cè)其RHD因第7外顯子。 4．采用多重PCR(Multiplex PCR-sequence specific primer，MPX-PCR)技術(shù)檢測(cè)所有176例樣本RHD因第3，4，5，6，7和9外顯子，擴(kuò)增產(chǎn)物以12﹪的聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)。 5．根據(jù)RHD基因的內(nèi)含子序列設(shè)計(jì)RHD基因的特異性測(cè)序引物，對(duì)部分樣本進(jìn)行RHD基因外顯子特異性PCR-SSP分析。對(duì)

9、RHD基因第6和10外顯子，采用高保真(Exparld high fidelity)PCR擴(kuò)增體系。 6．采用高保真PCR擴(kuò)增體系，擴(kuò)增部分樣本的Rh盒子基因的特異性序列并進(jìn)行測(cè)序分析。 7．對(duì)所有176例樣本采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restrictfragment length polymorphism，PCR-RFLP)技術(shù)進(jìn)行RHD基因的純合性測(cè)定。 8．采用根據(jù)RHD基因的內(nèi)含子序列設(shè)計(jì)的

10、RHD基因特異性測(cè)序引物，對(duì)部分樣本的RHD基因10個(gè)外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。 [結(jié)果]： 1．對(duì)176例RhD陰性樣本的分析表明，114例(65﹪)樣本在多重PCR-SSP分析中顯示缺失RHD基因，在PCR-RFLP分析中顯示為純合的RHD基因陰性。 2．49例(28﹪)樣本在血清學(xué)吸收放散試驗(yàn)中顯示為Del表型。其MPX-PCR分析顯示均存在RHD基因6個(gè)外顯子，PCR-RFLP分析顯示其中43

11、例為雜合的RHD基因，6例為純合的RHD基因。對(duì)該組中22例樣本的測(cè)序分析顯示均存在一個(gè)RHD因第9外顯子第1227位G>A的突變，該突變是Del表型所特有的。 3．12例(6﹪)樣本MPX-PCR顯示缺失RHD基因，但PCR-RFLP分析顯示存在1個(gè)RHD基因，進(jìn)一步的測(cè)序PCR分析表明它們至少存在RHD基因第1和10外顯子。 4．1例(1﹪)樣本MPX-PCR分析顯示存在RHD基因，但缺失第6外顯子。對(duì)其RHD因全部

12、10個(gè)外顯子的測(cè)序分析表明，該樣本存在一個(gè)新的933位C>A的突變。 5．對(duì)27例在多重PCR分析中顯示缺失RHD基因和在RFLP分析中為RHD基因陰性純合樣本的雜化Rh盒子基因進(jìn)行DNA測(cè)序分析，表明中國(guó)漢族人存在與高加索人相一致的雜化Rh盒子基因序列。 6．對(duì)8例部分D表型樣本的分子生物學(xué)分析表明，存在RHD基因的第1、7、8、9、10，缺失第3、4、5和6外顯子，其基因結(jié)構(gòu)與部分DVItype Ⅲ型相近。

13、[結(jié)論]： 1．RHD基因缺失，RHD因第1227位G>A Del型突變，RHD-CE-D雜化基因和一個(gè)新的933位CYA的突變是研究樣本中導(dǎo)致形成RhD陰性表型的四種分子機(jī)制。RHD基因缺失是引起中國(guó)漢族人RhD陰性表型形成的主要分子機(jī)理。 2．RHD因第1227位G>A Del型突變是引起基因定型和血清學(xué)定型結(jié)果不一致的主要原因。 3．中國(guó)漢族人RhD陰性個(gè)體存在與高加索人相一致的雜化Rh盒子基因序列。RHD