Survivin基因與源發(fā)性肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究.pdf

1、我國原發(fā)性肝癌病死率居所有惡性腫瘤的第二位，占全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的18.8％。乙型肝炎、肝炎后肝硬化則是我國肝癌發(fā)病率和病死率居高不下的主要原因。雖然手術(shù)切除仍是可能獲得治愈的主要方法，但根治性切除術(shù)后復(fù)發(fā)率仍然相當(dāng)高，還有更多的肝癌患者因腫瘤轉(zhuǎn)移而失去根治的機(jī)會(huì)。這是肝癌患者臨床治療失敗的主要原因，也是提高患者生存率和改善預(yù)后的重要障礙。因此探討肝癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的相關(guān)因素及分子機(jī)理，尋找肝癌早期診斷、預(yù)測轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)記和干預(yù)治

2、療的靶分子，對于這種惡性腫瘤的診斷和治療具有重要的理論指導(dǎo)和臨床應(yīng)用意義。
　　 Survivin基因由效應(yīng)蛋白EPR-1(effector cell protease receptor-1)cDNA在人類基因庫雜交篩選分離出來，全長14，700 bp，定位于17q25，編碼產(chǎn)生一個(gè)由142個(gè)氨基酸組成、相對分子質(zhì)量為16，500的蛋白質(zhì)。Survivin的主要生物學(xué)功能是抗凋亡，是目前已知作用最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白。目前，越來越多

3、的學(xué)者發(fā)現(xiàn)Survivin在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，特別是在高轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。有學(xué)者報(bào)道Survivin在轉(zhuǎn)移的肝癌患者樣本中表達(dá)的陽性率顯著高于無轉(zhuǎn)移患者，Survivin表達(dá)可能與原發(fā)性肝癌的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、門靜脈癌栓等惡性生物學(xué)行為有關(guān)，但該方面研究較少，而且具體作用機(jī)制如何還不明確。
　　 本課題旨在通過對比和分析不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞系Survivin表達(dá)差異及肝癌組織有和無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移病例中Survivin表達(dá)差異，研究Su

4、rvivin與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系；通過構(gòu)建Survivin表達(dá)載體pEGFP-C1/survivin重組質(zhì)粒，研究Survivin過表達(dá)后對肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移惡性表型的影響；通過構(gòu)建Survivin RNAi真核表達(dá)載體pGPU16/GFP/Neo-shRNA，探索下調(diào)Survivin基因表達(dá)對肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的治療效果，為肝癌轉(zhuǎn)移的基因治療提供新的靶點(diǎn)；并初步研究Survivin促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。
　　 第一部分：

5、Survivin在不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞系及肝癌組織中的表達(dá)
　　 本部分實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖茄芯坎煌D(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞系及肝癌組織中Survivin表達(dá)情況，分析Survivin表達(dá)與肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。應(yīng)用RT-PCR和WesternBlot方法檢測5種不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3和HCCLM6細(xì)胞Survivin表達(dá)情況。收集35例原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁組織

6、，其中包括20例無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移病例及15例存在肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的病例，RT-PCR和Western Blot方法檢測Survivin表達(dá)情況。RT-PCR結(jié)果表明，具有相同遺傳背景的轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞系隨侵襲轉(zhuǎn)移潛能升高Survivin表達(dá)依次升高(P<0.05)，HCCLM6細(xì)胞Survivin表達(dá)水平最高，Western Blot結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致。肝癌組織Survivin mRNA表達(dá)均為陽性，而癌旁組織無一例陽性表達(dá)。Survivin

7、 mRNA的表達(dá)水平在肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組(1.082±0.213)顯著高于無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組(0.799±0.224，P<0.05)。Western Blot的結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致。肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組Survivin蛋白表達(dá)(0.892±0.198)顯著高于無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組(0.342±0.237，P<0.05)。以上結(jié)果表明，Survivin在原發(fā)性肝癌中表達(dá)，且與侵襲轉(zhuǎn)移等腫瘤的惡性生物學(xué)行為有關(guān)，Survivin基因高表達(dá)可作為判斷HCC侵襲性和進(jìn)展

8、的一個(gè)潛在重要指標(biāo)。
　　 第二部分：Survivin過表達(dá)對肝癌細(xì)胞惡性表型的影響
　　 本部分實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖茄芯縎urvivin過表達(dá)后對肝癌細(xì)胞惡性表型的影響。首先構(gòu)建Survivin表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1/survivin，將其轉(zhuǎn)染低侵襲性無轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，以pEGFP-C1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染做對照，G418篩選獲得穩(wěn)定過表達(dá)Survivin細(xì)胞株C1和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞株C2，用Realtime P

9、CR和Western Blot方法檢測Survivin表達(dá)，體外MTT、黏附、運(yùn)動(dòng)、侵襲實(shí)驗(yàn)觀察Survivin過表達(dá)后細(xì)胞惡性表型的變化。制備18只SMMC-7721細(xì)胞裸鼠肝臟原位接種模型，隨機(jī)平均分成pEGFP-C1/survivin質(zhì)粒組，pEGFP-C1空質(zhì)粒對照組和PBS組。在肝臟原位接種腫瘤后第2天開始給藥，腹腔注射質(zhì)粒50μg/只，每周2次，連續(xù)給藥6周后處死，解剖觀察肝癌生長、轉(zhuǎn)移情況，RT-PCR、Western B

10、lot檢測肝癌組織中Survivin和OPN表達(dá)，肺組織切片H.E.染色觀察肺轉(zhuǎn)移情況。腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因芯片比較C1和C2細(xì)胞株基因表達(dá)差異。用Realtime PCR驗(yàn)證有差異表達(dá)H-ras基因。并檢測OPN基因、蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明，pEGFP-C1/survivin質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定構(gòu)建正確，將其轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞，Survivin表達(dá)水平明顯升高。體外試驗(yàn)顯示C1細(xì)胞黏附、體外運(yùn)動(dòng)、侵襲能力明顯高于C2細(xì)胞(細(xì)胞黏附率65

11、.33％±7.24％vs45.34％±5.52％，運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)15.3±2.34 vs5.3±2.53，侵襲試驗(yàn)透膜細(xì)胞數(shù)7.3±1.34 vs4.3±1.25，P均<0.05)，MTT結(jié)果顯示C1細(xì)胞24h、48h和72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測的OD值明顯高于C2細(xì)胞檢測值(P<0.05)。裸鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pEGFP-C1/survivin質(zhì)粒組腫瘤瘤重(2.72g±0.16g)明顯重于pEGFP-C1空質(zhì)粒對照組(1.79g±0.0

12、8g，P<0.05)和PBS組(1.75g±0.07g，P<0.05)。各組肝癌體積的差異趨勢與瘤重一致，pEGFP-C1/survivin質(zhì)粒組體積(1062.1mm3±376.0mm3)明顯大于pEGFP-C1空質(zhì)粒對照組(409.7mm3±380.3mm3，P<0.01)和PBS組(460.8mm3+32.3mm3，P<0.01)。pEGFP-C1/survivin質(zhì)粒組6只裸鼠中有5只發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，pEGFP-C1空質(zhì)粒對照組和P

13、BS組均無肺轉(zhuǎn)移發(fā)生，且pEGFP-C1/survivin質(zhì)粒組3只發(fā)生肝內(nèi)播散，而pEGFP-C1空質(zhì)粒對照組和PBS組裸鼠均無肝內(nèi)播散。RT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示pEGFP-C1/survivin質(zhì)粒組Survivin和OPN表達(dá)水平明顯高于pEGFP-C1空質(zhì)粒對照組和PBS組?；蛐酒容^發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定高表達(dá)Survivin后，有16個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)(H-ras、CTNNA1、CTNNB1、IL8RB、M

14、MP3、ITGB3等)，2個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)(TCF20和TP53)。Realtime PCR和ELISA結(jié)果顯示C1細(xì)胞H-ras和OPN表達(dá)水平明顯高于C2細(xì)胞。以上結(jié)果表明，Survivin基因表達(dá)上調(diào)后可促進(jìn)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的惡性侵襲轉(zhuǎn)移表型。Survivin高表達(dá)可引起多個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)水平改變，其中包括與肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的H-ras和OPN基因。
　　 第三部分：Survivin基因RN

15、Ai體外及體內(nèi)研究
　　 本部分實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察Survivin對肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，通過靶向Survivin RNA干擾抑制Survivin表達(dá)，觀察高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系HCCLM6細(xì)胞生長、黏附、侵襲能力以及體內(nèi)腫瘤生長及轉(zhuǎn)移行為的改變，探索靶向Survivin基因RNAi對肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的治療效果。首先設(shè)計(jì)、合成Survivin siRNA，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HCCLM6細(xì)胞，Realtime PCR和Western Blot檢

16、測干擾效果。篩選出干擾效率較高靶點(diǎn)用于合成shRNA，構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-shRNA干擾質(zhì)粒。重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HCCLM6細(xì)胞，Realtime PCR和Western Blot驗(yàn)證干擾效果，篩選出干擾效率較高的shRNA重組質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用MTT、黏附實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖、黏附、運(yùn)動(dòng)、侵襲能力的改變。Realtime PCR及ELISA方法檢測瞬時(shí)轉(zhuǎn)染shRNA干擾質(zhì)粒后細(xì)胞H-ras和OP

17、N表達(dá)。裸鼠實(shí)驗(yàn)觀察腹腔注射Survivin干擾質(zhì)粒對肝癌生長、轉(zhuǎn)移和裸鼠生存期的影響。RT-PCR和Western Blot檢測裸鼠肝癌組織Survivin和OPN表達(dá)水平。結(jié)果表明，針對Survivin基因設(shè)計(jì)的siRNA均有一定程度的干擾作用，Reaitime PCR顯示其中siRNA-166、siRNA-358的干擾作用較強(qiáng)，可使靶基因分別下調(diào)80％和70％，WesternBlot結(jié)果與Realtime PCR結(jié)果一致，siRN

18、A-166和siRNA-358可使Survivin蛋白分別下調(diào)72％和65％。分別構(gòu)建siRNA-166和siRNA-358兩種pGPU6/GFP/Neo-shRNA重組質(zhì)粒，并分別命名為shRNA1和shRNA2，經(jīng)測序鑒定插入位點(diǎn)正確。Realtime PCR檢測兩種重組質(zhì)粒干擾效果，結(jié)果示shRNA1和shRNA2對Survivin mRNA抑制率分別為78％和65％，蛋白抑制率達(dá)75％和68％，故選擇shRNA1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。s

19、hRNA1轉(zhuǎn)染HCCLM6后，體外增殖能力明顯降低，黏附率明顯低于陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，兩者差異有顯著性(43.28％±0.85％vs55.09％±1.45％，P<0.01)；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲能力明顯降低，與陰性對照質(zhì)粒相比兩者差異有顯著性(侵襲試驗(yàn)透膜細(xì)胞數(shù)10.5±1.29 vs20.5±1.29，P<0.01，運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)15.8±0.96 vs23.5±1.29，P<0.01)。Realtime PCR結(jié)果顯示細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染s

20、hRNA1干擾質(zhì)粒后，細(xì)胞H-ras和OPN mRNA表達(dá)降低，細(xì)胞上清OPN蛋白分泌量明顯減少(P<0.01)。裸鼠實(shí)驗(yàn)表明，shRNA1質(zhì)粒組腫瘤瘤重(1.43g±0.20g)低于陰性對照質(zhì)粒組(2.19g±0.37g，P<0.01)和PBS組(2.34g±0.55g，P<0.01)。shRNA1質(zhì)粒組腫瘤體積(679.22mm3±328.72mm3)小于陰性對照質(zhì)粒組(1397.03mm3±374.49mm3，P<0.01)和PB

21、S組(1636.50mm3±508.80mm3，P<0.01)。陰性對照質(zhì)粒組和PBS組6只裸鼠都發(fā)生了肺轉(zhuǎn)移，而shRNA1質(zhì)粒組只有2只裸鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。shRNA1質(zhì)粒組荷瘤裸鼠的生存期為70.7天±1.97天，與陰性對照質(zhì)粒組(40.8天±2.32天)和PBS組(37.5天±4.28天)相比差異顯著(P<0.01)。RT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示shRNA1質(zhì)粒組Survivin和OPN表達(dá)水平明顯低于陰性對照質(zhì)粒

22、組和PBS組。以上結(jié)果表明，Survivin基因可通過促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞黏附力、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲能力參與原發(fā)性肝癌的生長和轉(zhuǎn)移，Survivin基因下調(diào)后肝癌細(xì)胞侵襲潛能下降，裸鼠肝癌生長抑制，轉(zhuǎn)移能力降低，故認(rèn)為Survivin是潛在的治療原發(fā)性肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的靶標(biāo)。
　　 第四部分：Survivin促進(jìn)肝癌細(xì)胞惡性表型機(jī)制的初步研究
　　 第二、三部分研究結(jié)果表明，Survivin基因過表達(dá)后，OPN和H-ra

23、s基因表達(dá)上調(diào)；而當(dāng)干擾Survivin基因表達(dá)時(shí)，OPN和H-ras基因表達(dá)下調(diào)。本部分通過研究三者之間的關(guān)系，以初步探討Survivin促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。首先構(gòu)建Survivin表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/survivin和Survivin RNA干擾質(zhì)粒pGPU6/shRNA，并分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測Survivin表達(dá)變化。構(gòu)建含有OPN基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pOPNGL3并鑒定。設(shè)計(jì)并化學(xué)合成H-ras si

24、RNA序列，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HCCLM6細(xì)胞觀察干擾效果，篩選出干擾效果較好的靶點(diǎn)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將pcDNA3.1(-)/survivin和pOPNGL3共轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞，通過檢測熒光素酶活性反映OPN基因啟動(dòng)子活性，觀察OPN基因啟動(dòng)子活性的變化。將pGPU6/shRNA和pOPNGL3共轉(zhuǎn)染HCCLM6細(xì)胞，觀察OPN基因啟動(dòng)子活性的變化。將H-ras siRNA和pOPNGL3共轉(zhuǎn)染HCCLM6細(xì)胞，檢測OPN基因啟動(dòng)子活性。

25、將pcDNA3.1(-)/survivin、H-ras siRNA和pOPNGL3共轉(zhuǎn)染HCCLM6細(xì)胞，與共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)/survivin、siRNA-NC、pOPNGL3細(xì)胞(對照組1)和共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)、siRNA-NC、pOPNGL3細(xì)胞(對照組2)對比，觀察OPN基因啟動(dòng)子活性差異。結(jié)果表明：通過測序鑒定pcDNA3.1(-)/survivin和pGPU6/shRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。pcDNA3.1

26、(-)/survivin重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞后，Survivin mRNA表達(dá)水平升高，為SMMC-7721細(xì)胞2.173倍，高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(相對SMMC-7721細(xì)胞1.035倍)。干擾質(zhì)粒pGPU6/shRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HCCLM6細(xì)胞后，Survivin mRNA表達(dá)水平明顯低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，抑制效率達(dá)70.5％。測序鑒定OPN基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pOPNGL3構(gòu)建正確。4組H-rassiRNA分別瞬

27、時(shí)轉(zhuǎn)染HCCLM6細(xì)胞進(jìn)行Realtime PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)v-H-ras-121、v-H-Fas-282、v-H-ras-305、v-H-ras-489干擾效率分別是51％、75.3％、65.6％、34.5％，故選擇v-H-ras-282進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。Survivin過表達(dá)后，SMMC-7721細(xì)胞OPN基因啟動(dòng)子活性升高了187.76％。Survivin基因干擾后，HCCLM6細(xì)胞OPN啟動(dòng)子活性降低了61.3％。H-ras基因

28、干擾后，HCCLM6細(xì)胞OPN啟動(dòng)子活性降低了59.5％。pcDNA3.1(-)/survivin、H-ras siRNA共轉(zhuǎn)染HCCLM6細(xì)胞，三組RLU(相對發(fā)光值)分別是16.31±0.67(×104)、37.69±1.34(×104)和15.86±0.32(×104)，實(shí)驗(yàn)組與對照組1相比，熒光素酶相對活性明顯低于對照組1(P<0.01)，而與對照組2相比，沒有明顯差異(P>0.05)，說明Survivin過表達(dá)對OPN啟動(dòng)子的

29、激活作用，可以被H-ras表達(dá)下調(diào)所阻斷。以上結(jié)果表明，Survivin過表達(dá)可以促進(jìn)OPN基因啟動(dòng)子活性；H-ras基因可以通過調(diào)控OPN啟動(dòng)子活性，調(diào)控OPN基因表達(dá)；Survivin促進(jìn)OPN啟動(dòng)子活性的作用可以被H-ras RNAi阻斷。故認(rèn)為Survivin、H-ras和OPN三者之間可能存在密切的聯(lián)系，Survivin可能是通過促進(jìn)H-ras基因表達(dá)激活OPN基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而使其表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
　

30、　 1.Survivin表達(dá)和肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力相關(guān)；肝癌組織中Survivin表達(dá)與肝內(nèi)轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　 2.Survivin能促進(jìn)肝癌細(xì)胞系SMMC-7721侵襲轉(zhuǎn)移惡性表型。Survivin高表達(dá)可引起SMMC-7721細(xì)胞H-ras、OPN等多個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)改變。
　　 3.RNA干擾下調(diào)Survivin表達(dá)后，肝癌細(xì)胞HCCLM6增殖、黏附、侵襲能力下降，并引起裸鼠體內(nèi)腫瘤生長抑制及轉(zhuǎn)移能力下降，故

31、認(rèn)為Survivin是潛在的治療原發(fā)性肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的靶標(biāo)。
　　 4.原發(fā)性肝癌中Survivin高表達(dá)可以上調(diào)H-ras基因表達(dá)水平，而H-ras基因可以通過調(diào)控OPN啟動(dòng)子活性，上調(diào)OPN基因表達(dá)，Survivin、H-ras和OPN三者可能存在密切的聯(lián)系，并且發(fā)現(xiàn)Survivin促進(jìn)OPN啟動(dòng)子活性的作用可以被H-ras基因下調(diào)所阻斷。故認(rèn)為，Survivin促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移作用的部分機(jī)制可能是通過促進(jìn)H-ras基因表達(dá)

32、，激活OPN基因轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)的。
　　 創(chuàng)新點(diǎn)：
　　 1.發(fā)現(xiàn)并證實(shí)Survivin參與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程，為預(yù)測和治療原發(fā)性肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)提供了新靶標(biāo)。
　　 2.初步探索靶向Survivin的RNA干擾對肝癌細(xì)胞體外生長、侵襲、黏附力的影響及抑制體內(nèi)成瘤、轉(zhuǎn)移的治療效果。
　　 3.初步探索了Survivin促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，提示Survivin、H-ras和OPN三者可能存在密切的聯(lián)系，Surv