Sublytic C5b-9誘導GMCs增殖和ECM分泌分子機制及其信號通路.pdf

1、全文分為二部分： 第一部分 Sublytic C5b-9誘導GMCs合成Tsp-1、TGF-β<,1>及其促細胞增殖和ECM分泌的作用 目的：探討，亞溶解劑量的補體C5b-9復合物(sublytic C5b-9)刺激腎小球系膜細胞(Glomerular mesangial cells，GMCs)上調血小板反應蛋白-1(Thrombospondin-1，Tsp-1)和轉化生長因子-beta 1(Transforming g

2、rowthfactor-β<,1>，TGF-β<,1>)的基因表達，促進GMCs增殖與細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)分泌的作用。闡明Tsp-1與TGF-β<,1>、GMCs增殖和ECM分泌之間的相關關系。 方法：在確定sublytic C5b-9最佳濃度的基礎上，將體外培養(yǎng)的GMCs作不同的分組處理。應用Real-time PCR和Westem blotting分別檢測不同處理的GMCs，其Tsp

3、-1、TGF-β<,1>、細胞周期蛋白(cyclin D<,2>)和纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)mRNA豐度和蛋白表達水平，另用ELISA法測定GMCs培養(yǎng)上清中活化的TGF-β<,1>的含量，并用<'3>H-胸腺嘧啶核苷酸摻入量(<'3>H-thymidine incorporation，<'3>H-TdR)檢查GMCs的增殖情況。此外，利用合成的Tsp-1封閉肽段(GGWSHW，抑制TGF-β<,1>的活化)，觀察T

4、sp-1在由sublytic C5b-9誘導TGFβ<,1>的合成、GMCs增殖與ECM分泌中的作用。 結果：培養(yǎng)的GMCs在sublytic C5b-9復合物(5％anti-Thy 1 Ab和4％正常血清)刺激后18h，其Tsp-1、TGFβ<,1>mRNA和蛋白表達水平明顯上調，24 h時cyclin D<,2>、FN mRNA和蛋白的表達亦顯著增加，同時GMCs呈現(xiàn)明顯的增殖反應。而GGWSHW(Tsp-1的封閉肽)能顯著

5、減少由sublytic C5b-9誘導的TGFβ<,1>的合成，并且FNmRNA和蛋白的表達水平也明顯下調，但其對GMCs增殖影響并不顯著。 結論：Sublytic C5b-9能夠誘導GMCs合成Tsp-1、TGFβ<,1>，促進GMCs增殖和ECM分泌，其ECM的分泌可能與Tsp-1、TGFβ<,1>的合成有一定的關系。 第二部分沉默Pi3-k/Akt基因對sublytic C5b-9促進GMCs合成Tsp-1，TGF

6、β<,1>及其細胞增殖和ECM分泌的影響 目的：從基因水平上探討沉默磷脂酰肌醇3-激酶(Pi3-k)/Akt基因對sublytic C5b-9誘導Tsp-1、TGF-β<,1>的合成，促進GMCs增殖和ECM分泌的影響。 方法：根據(jù)Pi3-k/Akt靶基因序列的不同區(qū)域設計出了8對小干涉RNA(small interference RNA，siRNA)。體外將不同的Pi3-k/Akt發(fā)夾狀RNA(small hairpi

7、n RNA，shRNA)轉染入GMCs后，篩選干擾效率最佳的Pi3-k shRNA(shPi3-k)和Akt shRNA(shAkt)，將GMCs作相應的分組處理。以Real-time PCR檢測各組GMCs中Tsp-1、TGF-β<,1>、cyclin D<,2>和FNmRNA豐度，Western blottingg檢磷酸化Akt(P<'*>-Akt)，總Akt(T-Akt)，Tsp-1，cyclin D<,2>和FN蛋白表達水平，另

8、用ELISA法檢測各組GMCs培養(yǎng)上清TGF-β<,1>的含量。此外，用<'3>H-TdR檢查GMCs的增殖水平。 結果：將8對shRNA質粒分別轉染GMCs，發(fā)現(xiàn)，shPik3c3-2和shAktl-4能明顯減低GMCs中P<'*>-Akt和T-Akt的蛋白表達水平，而用shPik3c3-2、shAktl-4、shPik3c3-2+shAktl-4分別轉染GMCs，再行sublytic C5b-9刺激，其Tsp-1、TGF-β