馬TRIM5α激活A(yù)P-1信號通路的分子機(jī)制研究.pdf

1、TRIM5α是TRIM家族的一個成員，具有典型的RBCC結(jié)構(gòu)（RING、B-box和Coil-Coiled）和一個C端SPRY結(jié)構(gòu)域。TRIM5α是存在于多種宿主細(xì)胞內(nèi)的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒天然免疫限制因子，可通過SPRY結(jié)構(gòu)靶向降解逆轉(zhuǎn)錄病毒衣殼蛋白（CA）和激活天然免疫來發(fā)揮抗病毒功能。前期研究證明，相對于其它動物而言，馬TRIM5α具有獨(dú)特的分子特征，在進(jìn)化過程中缺失了重要的C末端結(jié)構(gòu)域而失去降解EIAV的CA蛋白功能，但過表達(dá)后仍明顯限

2、制馬傳染性貧血病病毒（EIAV）的感染。為了進(jìn)一步確定這個結(jié)果，本論文利用慢病毒表達(dá)載體建立了穩(wěn)定表達(dá)馬TRIM5α和恒河猴 TRIM5α的HEK293細(xì)胞系，并進(jìn)行了抗病毒實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示馬TRIM5α表現(xiàn)出明顯的限制EIAV感染作用。同時，利用AP-1和NF-κB熒光素酶報告系統(tǒng)檢測馬 TRIM5α激活天然免疫的活性，結(jié)果證明了馬 TRIM5α可以很好地激活A(yù)P-1和NF-κB信號通路。上述結(jié)果說明由于馬 TRIM5α沒有完整的 SP

3、RY結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其不能靶向降解 EIAV的 Gag蛋白，但是馬TRIM5α仍可以發(fā)揮抗病毒功能并激活天然免疫信號，因此這提示我們馬TRIM5α可能是通過激活天然免疫來抵抗病毒感染。
　　靈長類TRIM5α發(fā)揮天然免疫激活功能依賴完整的SPRY結(jié)構(gòu)域，而馬TRIM5α蛋白僅包含五分之一SPRY結(jié)構(gòu)，仍能顯著激活天然免疫信號通路。這提示不同種屬TRIM5α發(fā)揮激活天然免疫功能的分子基礎(chǔ)與分子機(jī)制不同。為了確定馬TRIM5α激活A(yù)P-1信號

4、通路的關(guān)鍵氨基酸，本研究對馬 TRIM5α從 C端開始進(jìn)行截短表達(dá)，構(gòu)建了截短表達(dá)突變體（ eqTRIM5-333、eqTRIM5-328、eqTRIM5-324、eqTRIM5-318、eqTRIM5-310、eqTRIM5-303、eqTRIM5-282），利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)初步確定了馬TRIM5α激活A(yù)P-1的關(guān)鍵氨基酸在第303位至第310位氨基酸這7個氨基酸之間。因此在eqTRIM5-310的基礎(chǔ)上對這7個氨基酸逐一進(jìn)行了

5、點(diǎn)突變，構(gòu)建了重組質(zhì)粒（ eqTRIM5-310-303、eqTRIM5-310-304、eqTRIM5-310-305、eqTRIM5-310-306、eqTRIM5-310-307、eqTRIM5-310-308、eqTRIM5-310-309），確定了馬TRIM5α激活A(yù)P-1的關(guān)鍵氨基酸是第303位蘇氨酸和第304位亮氨酸，并且這兩個氨基酸對其激活NF-κB也是重要的。為進(jìn)一步研究馬 TRIM5α激活 AP-1信號通路的分子機(jī)制

6、，我們將馬 TRIM5α及其突變體分別和TAB2、TAK1共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，結(jié)果表明馬TRIM5α及其突變體可以降解TAB2，但是失去激活作用的突變體均失去了與TAK1的相互作用。通過將馬TRIM5α及其突變體、TAK1、泛素（Ub）共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，結(jié)果表明馬TRIM5α可能是通過泛素化TAK1進(jìn)而激活下游的AP-1和NF-κB信號通路。
　　本研究揭示了馬TRIM5α激活A(yù)P-1信號通路的分子機(jī)制，提示馬TRIM5α可能是通過