bHLH基因ngn1、ngn3和ash1體外誘導(dǎo)雞胚RPE再程序化為視網(wǎng)膜神經(jīng)元.pdf

1、目的：
　　 原發(fā)或繼發(fā)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞變性最終導(dǎo)致不可逆盲。這類疾病臨床上目前尚無有效的治療措施，因?yàn)樯窠?jīng)元是不可再生的細(xì)胞。眾多的實(shí)驗(yàn)方法中，細(xì)胞移植替代技術(shù)最有可能成為一種治療神經(jīng)元變性的有效途徑。細(xì)胞替代治療成功的首要前提是：有穩(wěn)定的、免疫組織相容程度高的供體細(xì)胞。本論文旨在探討雞胚視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞能否被活化型bHLH基因neurogenin1(ngn1)、ngn3和ash1在體外再程序化為視網(wǎng)膜神經(jīng)元并且鑒定不同基因

2、誘導(dǎo)的神經(jīng)元類型。
　　 方法：
　　 neurogenin1(ngn1)，ngn3和ash1的全長(zhǎng)mRNA序列克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒RCAS前病毒載體中，于雞胚纖維母細(xì)胞中組裝病毒，收集并提純一定濃度的病毒顆粒。RCAS-GFP作為對(duì)照病毒。清潔級(jí)受精雞蛋孵育到胚胎第2.5天(E2.5)時(shí)視網(wǎng)膜下分別顯微注射攜帶三種基因病毒懸液。因RCAS在雞胚體內(nèi)可以整合到細(xì)胞中，并隨細(xì)胞的分裂增殖得到擴(kuò)散，所以發(fā)育中分裂旺盛的胚眼視網(wǎng)膜

3、神經(jīng)層和色素上皮可以被攜帶基因的病毒感染。病毒感染率通過對(duì)病毒蛋白P27的表達(dá)情況監(jiān)測(cè)進(jìn)行推測(cè)。注射后的雞胚繼續(xù)孵育到一定發(fā)育階段(E6，E7.5或E12)時(shí)，RPE組織從胚眼中分離并平鋪于Transwell()插入培養(yǎng)皿中體外培養(yǎng)一定時(shí)間。為了排除血清中的生長(zhǎng)因子(如bFGF)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，一律采用含20％血清替代品的Knock-out DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。體外培養(yǎng)一段時(shí)間后，將RPE組織固定并以O(shè)CT/蔗糖混合物冷凍包埋，然后

4、制作5-10μm的冰凍切片。常規(guī)熒光標(biāo)記的免疫組織化學(xué)染色法及改良的原位雜交技術(shù)用于檢測(cè)感染病毒的攜帶的三種基因能否將RPE細(xì)胞再程序化。此處指的改良原委雜交技術(shù)是指，常規(guī)原位雜交顯色完成后加一步細(xì)胞脫色素的過程以利于原位雜交信號(hào)觀察。實(shí)驗(yàn)中所用的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞標(biāo)記包括：視錐蛋白(visinin)：視錐細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)的一種鈣結(jié)合蛋白；視紅素、視紫紅質(zhì)，感光器間視黃醇類結(jié)合蛋白片段(IRBP)等視色素；光傳導(dǎo)通路中涉及的a.轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(α-tr

5、ansducin，ALT)以及突觸相關(guān)蛋白SNAP-25和PSD-95等。視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的標(biāo)記蛋白包括RA4，Brn3A和3A10等。另外尚使用Calretinin識(shí)別水平細(xì)胞，雙極細(xì)胞，無長(zhǎng)突細(xì)胞和節(jié)細(xì)胞；LIM(4H6)識(shí)別水平細(xì)胞。通過研究RPE細(xì)胞本身特有的基因mmp115(115 kDa大小的melanosomal matrix protein)的表達(dá)水平，了解RPE過表達(dá)活化型bHLH基因后自身特質(zhì)的改變。同時(shí)也檢驗(yàn)了在眼部組

6、織發(fā)育過程中起重要作用的基因Pax6和chx10的水平變化。RPE再程化過程中的細(xì)胞增值能力通過檢查細(xì)胞整合bromodeoxyuridine(BrdU)的情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。在ngn1處理的RPE細(xì)胞內(nèi)通過同時(shí)標(biāo)記visinin和BrdU了解光感受器細(xì)胞生成過程是否伴隨細(xì)胞增殖。
　　 結(jié)果：
　　 為使RPE組織可以有效的黏附在transwell()膜上，最早固定的一批標(biāo)本為分離、培養(yǎng)后4小時(shí)，此時(shí)ngn3處理的RPE組織

7、中有較多的visinin陽性細(xì)胞出現(xiàn)，ngn1處理者僅有極個(gè)別細(xì)胞為visinin陽性，而ash1處理的組織中未見神經(jīng)元特意性蛋白表達(dá)。2-3天以后ngn1,ngn3處理的組織內(nèi)均見到大量的visinin+細(xì)胞，個(gè)別部位夾雜RA4+，Calretinin+和H5+細(xì)胞。這些visinin+細(xì)胞在8DIV尤其是16DIV時(shí)表達(dá)諸多較成熟的感光細(xì)胞特有的標(biāo)記基因：視紅素，視紫紅質(zhì)IRBP和ALT以及突觸相關(guān)蛋白SNAP-25和PSD-95。

8、GFP對(duì)照組織中Pax6的表達(dá)較少，其在ngn1過表達(dá)組織中的特點(diǎn)為：visinin+細(xì)胞中的表達(dá)水平高，而visinin+細(xì)胞中Pax6表達(dá)明顯減少。visinin+細(xì)胞中mmp115的表達(dá)量明顯下調(diào)。另外，E18 RPE組織體外加入RCAS-ngn3后在15DIV同樣有大量的visinin+細(xì)胞可以檢測(cè)到。組織培養(yǎng)伊始加入BrdU，培養(yǎng)兩天后，無論在對(duì)照組還是處理組，均可觀察到有多數(shù)細(xì)胞整合BrdU。BrdU和visinin的雙標(biāo)記

9、顯示大部分visinin+細(xì)胞為兩種分子雙標(biāo)記，有小部分細(xì)胞只表達(dá)visinin。RCAS-ash1可將RPE組織向不同的方向再程序化，子細(xì)胞表達(dá)多種蛋白：visinin，RA4，3A10，Brn3A，Calretinin和4H6。但即使在體外培養(yǎng)的第16天，visinin+細(xì)胞內(nèi)未見有視紅素等視色素表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 RPE組織在體外可以旺盛增殖。RCAS-ngn1或ngn3過表達(dá)的情況下RPE組織丟掉了它們作