子宮肌瘤動物模型細胞凋亡及其調控因素的研究.pdf

1、子宮肌瘤是婦科常見疾病，發(fā)病率有逐年升高的趨勢，至少有25﹪生育期女性有明顯的臨床癥狀，手術標本病理檢查診斷率可達77﹪，嚴重影響女性的身心健康。子宮肌瘤確切的發(fā)病機制尚不完全明了，現(xiàn)已研究證明有多種因素參與了肌瘤的生長，其中細胞凋亡受抑制是主要的影響因素之一，在眾多凋亡基因中，bcl-2和bax表達與子宮肌瘤細胞凋亡異常最為密切。 腫瘤細胞生物學研究表明，細胞凋亡受抑制在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，其中bcl-2基因家族

2、在調控細胞凋亡中起著關鍵性作用。bcl-2家族由一系列與bcl-2同源的基因組成，目前共發(fā)現(xiàn)15個家族成員，他們分別對細胞凋亡起著促進或抑制作用，bcl-2和bax是其中最重要的凋亡正負調節(jié)基因。bcl-2是最早發(fā)現(xiàn)的哺乳類凋亡調控基因，其生物學功能是延長細胞壽命并抑制多種刺激誘導的細胞凋亡。而bax能拮抗bcl-2的作用，其表達增多時促進細胞凋亡。bcl-2家族成員相應的蛋白自身或彼此之間能形成二聚體，蛋白-蛋白的相互作用調節(jié)著細胞的

3、存活與凋亡，以bcl-2和bax的相互作用為中心。bcl-2與bax的二聚體使bcl-2失去抑制細胞死亡的功能，因此兩者在細胞內的比例是細胞凋亡的調節(jié)因素之一。細胞凋亡與增殖是細胞最重要的生命活動現(xiàn)象，以往認為是兩個完全互不相關的過程，目前認為細胞凋亡與增殖既相互聯(lián)系又相互制約并受到一系列信號及其傳導機制的調控，細胞凋亡和增殖平衡的失調是腫瘤發(fā)生的重要原因。細胞增殖加強而凋亡速度減慢，或應凋亡的細胞沒有凋亡，致使細胞數(shù)目增多，也是腫瘤發(fā)

4、生的重要機制之一。 以往的研究認為細胞凋亡僅存在于惡性腫瘤中，但近年的研究發(fā)現(xiàn)，屬于良性腫瘤范疇的子宮肌瘤的發(fā)生和發(fā)展與細胞凋亡密切相關。自1997年Matsuo等首次報道子宮肌瘤患者肌瘤內bcl-2表達在分泌期高于增生期以來(孕激素(P)水平分泌期高于增生期)，國內外許多學者對子宮肌瘤中細胞凋亡基因及其與性激素關系進行了研究。李衛(wèi)平等報道肌瘤內bcl-2mRNA增多，baxmRNA減少，bcl-2/baxmRNA增大；肌瘤內雌

5、激素受體(ER)和孕激素受體(PR)與bcl-2/baxmRNA呈正相關，其中PR與bcl-2/baxmRNA的相關性更強。目前研究認為，子宮肌瘤雖然是良性腫瘤，但也存在細胞凋亡異?，F(xiàn)象。性激素對子宮肌瘤一方面通過某些機制促進細胞增殖，另一方面雌激素(E)、P尤其是P通過調控調亡基因bcl-2或bcl-2/bax抑制細胞凋亡，從而間接刺激肌瘤細胞數(shù)目增多，這是肌瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制之一。 動物模型是研究人類疾病發(fā)生機制及其治療方

6、法的重要手段。相對于臨床研究，子宮肌瘤動物模型研究的報道很少，但是有逐年增加的趨勢。目前國外應用的子宮肌瘤動物模型主要有三種，外源性性激素給予豚鼠模型，轉基因小鼠模型和自發(fā)性Eker大鼠模型。國內由于條件所限，只使用其中外源性性激素給予的子宮肌瘤動物模型。該模型雖存在造模時間長的缺點，但其病理組織學表現(xiàn)與人類疾病有較大的相似性，有一定的應用價值。豚鼠是國內外外源性性激素造模的首選動物，國內除豚鼠外，還常選用大鼠。 子宮肌瘤模型動

7、物細胞凋亡及其調控因素的研究未見公開文獻報道，同時，大鼠和豚鼠做為子宮肌瘤動物模型的差異性未見報道。因此，本論文在外源性性激素致豚鼠及大鼠子宮肌瘤模型的基礎上，對模型動物中細胞凋亡及其調控因素進行研究，探討模型與臨床疾病的相關性；同時探討大鼠和豚鼠做為子宮肌瘤模型動物的差異性。 1目的在復制的大鼠及豚鼠子宮肌瘤模型基礎上，對模型動物中細胞凋亡及其調控因素進行研究，探討動物模型與臨床的相關性；同時探討大鼠和豚鼠做為子宮肌瘤動物模型

8、的差異性。 2方法肌注雌二醇(E2)3個月加注孕激素(P)1個月分別復制子宮肌瘤大鼠和豚鼠模型。細胞凋亡研究包括細胞凋亡形態(tài)學觀察，細胞凋亡生化特征觀察和凋亡基因bcl-2和bax測定。細胞凋亡形態(tài)學通過子宮石蠟切片HE染色光學顯微鏡觀察。利用動物基因DNA快速提取試劑盒提取子宮組織DNA，對提取的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像分析系統(tǒng)觀察細胞凋亡時染色質DNA斷裂的生化特征。bcl-2和bax的測定，大鼠模型采用免疫組

9、織化學SABC法，豚鼠模型采用ELISA法。在豚鼠模型中分別測定子宮體部和分角根部bcl-2和bax表達，并計算其比值。細胞凋亡調控因素研究包括血清E2、P水平測定，子宮大體形態(tài)學和病理形態(tài)學觀察。血清E2、P水平測定方法采用放射免疫分析法，并分析E2、P水平與bcl-2、bax、bcl-2/bax的相關性。子宮大體形態(tài)學觀察包括子宮重量、直徑及肉眼觀，子宮病理形態(tài)學觀察包括子宮平滑肌厚度等。 3結果3.1細胞凋亡研究3.1.1

10、細胞凋亡形態(tài)學觀察大鼠和豚鼠模型中，子宮平滑肌層未見凋亡細胞，子宮內膜偶爾可見散在分布的凋亡細胞，核呈藍黑色，胞漿呈淡紅色，核染色質致密濃縮、碎裂等。 3.1.2細胞凋亡生化特征觀察大鼠模型子宮組織DNA電泳結果出現(xiàn)一條距加樣孔很近的大分子條帶，但沒有出現(xiàn)細胞凋亡典型生化特征“梯狀”條帶。 3.1.3凋亡基因表達的測定子宮肌瘤模型大鼠子宮切片免疫組化顯色結果顯示，模型組和空白組均可見棕黃色顆粒，即表示bcl-2和bax蛋

11、白的陽性顯色。棕黃色顆粒主要出現(xiàn)在細胞漿，散在于子宮環(huán)行平滑肌層，內膜和漿膜未見。利用圖象分析儀軟件分析系統(tǒng)進行統(tǒng)計，結果顯示，模型組平滑肌bcl-2蛋白陽性點數(shù)目明顯增多，陽性信號顯著增強，bax蛋白陽性點數(shù)目明顯減少，陽性信號顯著減弱，與空白組比較均有顯著性差異。 子宮肌瘤模型豚鼠子宮勻漿ELISA檢測結果顯示，與空白組比較，模型組子宮體部和根部組織的bcl-2表達明顯增多，bax表達明顯減少，bcl-2/bax比值明顯增大

12、；模型組子宮根部與體部相比，各指標均沒有顯著性差異。 3.2凋亡調控因素的研究3.2.1血清E2、P水平模型大鼠血清激素水平的檢測結果顯示，與空白組比較，E2水平明顯升高，P水平有升高趨勢，但沒有顯著性差異，E2/P比值明顯增大。 模型豚鼠血清激素水平的檢測結果顯示，與空白組比較，E2水平明顯升高，P水平和E2/P比值有升高趨勢，但沒有顯著性差異。P水平與子宮體部bcl-2/bax比值呈正相關。 3.2.2子宮大

13、體形態(tài)3.2.2.1子宮重量及分角根部橫、豎徑與空白組比較，模型大鼠和豚鼠子宮重量及其系數(shù)明顯增大；子宮分角根部橫、豎直徑明顯增大。 3.2.2.2子宮肉眼觀察與空白組相比，模型大鼠子宮明顯增粗，根部明顯腫脹。 與空白組相比，模型豚鼠子宮明顯增粗，根部明顯腫脹。漿膜面充血淤血，顏色不均勻。 3.2.3子宮組織形態(tài)學觀察與空白組比較，大鼠子宮平滑肌明顯增厚，平滑肌束明顯增粗，平滑肌細胞明顯增多，大小不均，核濃染。

14、 與空白組比較，豚鼠子宮平滑肌明顯增厚，平滑肌束明顯增粗，排列不規(guī)則，散在漩渦狀結構，平滑肌細胞明顯增多，胞漿、胞核體積比失調，大小不均，核濃染。 3.3動物模型成功標志的比較相同點：大鼠和豚鼠模型均可見，血清E2水平明顯升高；子宮重量增大；子宮分角根部明顯腫大、增粗；子宮平滑肌層明顯增厚，肌束明顯增粗；平滑肌細胞明顯增多。 異同點：豚鼠較大鼠子宮分角根部腫脹明顯，子宮漿膜面明顯充血淤血；豚鼠子宮肌束排列明顯不規(guī)則