胃潰瘍復(fù)發(fā)大鼠胃組織的蛋白質(zhì)組學(xué)研究與健胃愈瘍顆粒干預(yù).pdf

1、背景:消化性潰瘍(Peptic Ulcer,PU)是臨床常見病、多發(fā)病,隨著潰瘍病治療藥物的進(jìn)展,PU的近期愈合已不成問題,但其復(fù)發(fā)問題一直是潰瘍病研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。胃潰瘍(Gastric Ulcer,GU)作為消化性潰瘍的常見類型,其復(fù)發(fā)是一涉及多因素改變的復(fù)雜過程,雖然從基因和轉(zhuǎn)錄水平已對(duì)其進(jìn)行了許多成功的研究,但其病理機(jī)制仍不十分明確,尚缺乏有效的用于早期診斷及預(yù)后檢測(cè)的特異性分子標(biāo)志物,若能直接從蛋白質(zhì)組學(xué)入手來研究,將能更全面

2、、真實(shí)地揭示其病理機(jī)制,為GU復(fù)發(fā)的發(fā)病學(xué)、預(yù)防診治以及新藥開發(fā)提供新的線索。蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)及其研究技術(shù)的發(fā)展和完善使得從蛋白質(zhì)整體水平上研究GU復(fù)發(fā)及其潰瘍相關(guān)性疾病的分子機(jī)制成為可能。
　　目的:1.研究白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)所致GU復(fù)發(fā)大鼠胃組織的蛋白質(zhì)表達(dá),探討GU復(fù)發(fā)的相關(guān)發(fā)病機(jī)制;2.分析健胃愈瘍顆粒(JianWeiYuYang granule,JWYY)干預(yù)IL-1β所致GU復(fù)

3、發(fā)大鼠胃組織的蛋白質(zhì)表達(dá)變化,探討JWYY抗GU復(fù)發(fā)的作用機(jī)理。
　　方法:1.GU復(fù)發(fā)大鼠模型的制備及JWYY干預(yù):①將80只大鼠隨機(jī)分為4組,即正常對(duì)照組(10只)、假手術(shù)對(duì)照組(10只)、GU模型組(40只)、JWYY組(20只),采用改良的Okabe乙酸涂抹法復(fù)制實(shí)驗(yàn)性GU模型,正常對(duì)照組不造模,假手術(shù)對(duì)照組以生理鹽水代替乙酸,造模后24h,JWYY組灌服JWYY藥液,劑量為0.081g/1ml/100g體重,其余各組灌服

4、蒸餾水,劑量均為1ml/100g體重,每天1次。造模后第90d,再將GU模型組大鼠隨機(jī)分為GU模型組和GU模型復(fù)發(fā)組各半,采用IL-1β復(fù)制GU復(fù)發(fā)模型,正常對(duì)照組、假手術(shù)對(duì)照組、GU模型復(fù)發(fā)組、JWYY組大鼠分別腹腔注射IL-1β(1μg/kg體重),GU模型組以生理鹽水代替IL-1β腹腔注射;②分別于造模后第8d、92d(即復(fù)發(fā)潰瘍誘導(dǎo)后48h)均分2批處死各組大鼠,剖腹取胃,在對(duì)胃大體情況、胃潰瘍指數(shù)(Gastric ulcer

5、index,GUI)進(jìn)行檢測(cè)后,剪取胃竇部含潰瘍處(無潰瘍者則于相應(yīng)部位取材)胃組織行HE染色(hematoxylin andeosin stain,HE stain)、雙向凝膠電泳(Two dimensional electrophoresis,2-DE)、免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IH)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reactio

6、n,RT-PCR)、免疫印跡(Western blot)。2.GU復(fù)發(fā)大鼠胃組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究及JWYY干預(yù):應(yīng)用固相pH梯度(Immobilized pH gradient,IPG)2-DE技術(shù)分別分離正常組、GU模型組、GU模型復(fù)發(fā)組及JWYY組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)胃組織總蛋白質(zhì)后,經(jīng)考染顯色、PDquest圖像分析、識(shí)別差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn),應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laserdesorpt

7、ion/ionization time of flight mass,MALDI-TOF-MS)分析得到肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprint,PMF),再經(jīng)Mascot軟件搜索SWISS-PROT和NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì),并利用生物信息學(xué)資源對(duì)所鑒定蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行分析。3.差異蛋白質(zhì)HSP27(Heat Shock Protein 27)、GRP78(Glucose-RegulatedProtein

8、 78)結(jié)果驗(yàn)證:為了驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定結(jié)果的可靠性,采用免疫組化、RT-PCR及Western blot方法對(duì)2個(gè)可能與GU復(fù)發(fā)及JWYY作用相關(guān)的差異蛋白質(zhì)HSP27、GRP78于蛋白及mRNA水平的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證分析。
　　結(jié)果:1.GU復(fù)發(fā)大鼠模型的制備及JWYY干預(yù):造模后第8d,經(jīng)乙酸造模的各組大鼠胃黏膜肉眼觀察和組織學(xué)檢查均可見到潰瘍病灶,但潰瘍程度不一,GU模型組GUI最高,JWYY組GUI顯著低于模型組(P<0

9、.05)。至第92d,GU模型復(fù)發(fā)組、JWYY組潰瘍復(fù)發(fā)率分別為90％,20%,后者與前者比較有顯著性差異(P<0.01);2.GU復(fù)發(fā)大鼠胃組織的蛋白質(zhì)組學(xué)研究及JWYY干預(yù):①GU復(fù)發(fā)大鼠胃組織雙向凝膠電泳圖譜的建立及圖像分析:建立了正常組、GU模型組、GU模型復(fù)發(fā)組及JWYY組大鼠胃組織的2-DE圖譜。在相同的設(shè)定值時(shí)檢測(cè)到的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)分別為:正常組935±29個(gè),GU模型組8d、92d分別為1012±23、1068±32個(gè),GU

10、模型復(fù)發(fā)組為1109±24個(gè),JWYY組8d、92d分別為1002±43、1023±36個(gè)。經(jīng)背景消減后,分別將其中的一塊膠定為參考膠進(jìn)行3塊膠間的蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配,結(jié)果得到正常組的平均匹配點(diǎn)數(shù)為867±31個(gè),GU模型組8d、92d分別為957±28、989±42個(gè),GU模型復(fù)發(fā)組為1007±35,JWYY組8d、92d分別為886±31、936±48個(gè),其平均匹配百分率分別為92.7%、94.6%、92.6%、90.8%、88.4%、

11、91.5%。不同膠蛋白質(zhì)點(diǎn)在IEF方向的偏差為0.901±0.125 mm,在SDS-PAGE方向上的偏差為1.108±0.102 mm;②各組大鼠胃組織2-DE圖譜差異點(diǎn)分析:比較分析各組大鼠胃組織的2-DE圖譜,GU模型組8d與正常組之間有282個(gè)差異點(diǎn),65個(gè)在GU模型組表達(dá)上調(diào),217個(gè)表達(dá)下調(diào);JWYY組8d與GU模型組之間有216個(gè)差異點(diǎn),157個(gè)在JWYY組表達(dá)上調(diào),59個(gè)表達(dá)下調(diào);GU模型復(fù)發(fā)組與正常組之間有189個(gè)差異

12、點(diǎn),73個(gè)在GU模型復(fù)發(fā)組表達(dá)上調(diào),116個(gè)表達(dá)下調(diào);JWYY組92d與GU模型復(fù)發(fā)組之間有168個(gè)差異點(diǎn),115個(gè)在JWYY組表達(dá)上調(diào),53個(gè)表達(dá)下調(diào);③通過比較正常組、GU模型復(fù)發(fā)組及JWYY組雙向凝膠電泳圖譜的差異,發(fā)現(xiàn)并鑒定了15個(gè)可能與GU復(fù)發(fā)及JWYY干預(yù)相關(guān)的蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)的功能涉及分子伴侶、細(xì)胞骨架蛋白、物質(zhì)代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)、能量產(chǎn)生、抗氧化應(yīng)激、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及血液蛋白等。3.差異蛋白質(zhì)HSP27、GRP78結(jié)果驗(yàn)證:免疫組化

13、、RT-PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,HSP27、GRP78在正常胃組織中有少量表達(dá),8d時(shí)GU模型組中表達(dá)明顯增加(P<0.01),8d、92d時(shí)JWYY組中表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P<0.01),證實(shí)了正常組、GU模型復(fù)發(fā)組及JWYY組中HSP27、GRP78于蛋白、mRNA表達(dá)水平與2-DE結(jié)果相一致。
　　結(jié)論:1.JWYY能促進(jìn)乙酸誘導(dǎo)的GU大鼠潰瘍愈合,降低其GUI,改善潰瘍愈合質(zhì)量(QOUH),降低IL-1β

14、誘導(dǎo)的GU復(fù)發(fā)大鼠的潰瘍復(fù)發(fā)率;2.成功建立了正常組、GU模型復(fù)發(fā)組及JWYY組的雙向凝膠電泳(2-DE)圖譜,鑒定了15個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì),提示GU復(fù)發(fā)是一多種蛋白質(zhì)參與的復(fù)雜過程,大鼠胃組織的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析是篩選GU復(fù)發(fā)病變相關(guān)蛋白質(zhì)的可靠方法之一;JWYY可調(diào)節(jié)GU復(fù)發(fā)大鼠胃組織的多種蛋白質(zhì)表達(dá),提示該復(fù)方具有多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn);3.HSP27、GRP78的免疫組化、RT-PCR及Western blot驗(yàn)證結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)分析