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文檔簡(jiǎn)介
1、鐵是人體中必不可少的微量元素,它參與DNA的合成,蛋白質(zhì)的形成,氧的運(yùn)輸和能量代謝等活動(dòng),而維持體內(nèi)鐵平衡具有至關(guān)重要的作用,其中,hepcidin-ferroportin軸從根本上負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)鐵的供應(yīng),利用,回收和儲(chǔ)存,而鐵調(diào)素(hepcidin)的缺乏會(huì)使膳食中鐵的吸收和巨噬細(xì)胞鐵釋放增強(qiáng),導(dǎo)致在血清和器官中出現(xiàn)過(guò)量的鐵,鐵的過(guò)量與這些器官的發(fā)病率密切相關(guān)。鐵調(diào)素(hepcidin)的減少已經(jīng)被證明與一些類型的遺傳性血色素沉著癥(HH)
2、和β-地中海貧血有著密切的關(guān)系,提高h(yuǎn)epcidin這種治療方法已經(jīng)被提出并用于治療由于鐵過(guò)載所導(dǎo)致的這些疾病。在傳統(tǒng)中醫(yī)治療中,許多中草藥已被用于治療或者改善這些疾病,眾所周知的,一些中藥具有補(bǔ)血養(yǎng)血或者活血化瘀的作用,而這些作用是否是由于影響和調(diào)節(jié)hepcidin的表達(dá)所引起的尚不清楚,但卻是一個(gè)值得研究的可能性。而且,到目前為止,從傳統(tǒng)中草藥中提取的天然化合物并沒(méi)有被用于做相關(guān)的研究。
在我們的研究中,我們的目的是篩選用
3、于治療由于基因突變或缺失導(dǎo)致低Hepcidin和鐵負(fù)荷疾病的天然化合物。在研究中,我們用啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和實(shí)時(shí)定量PCR兩種方法來(lái)檢測(cè)鐵調(diào)素(hepcidin)基因的表達(dá),并月動(dòng)物模型來(lái)驗(yàn)證,從而研究14從傳統(tǒng)中草藥中純植物提取的天然化合物對(duì)hepcidin表達(dá)的影響。經(jīng)過(guò)我們的反復(fù)篩選和驗(yàn)證,證明淫羊藿苷和鹽酸小檗堿這兩種天然化合物對(duì)肝細(xì)胞中hepcidin轉(zhuǎn)錄及表達(dá)產(chǎn)生一個(gè)強(qiáng)有力的刺激作用,進(jìn)一步研究機(jī)制研究表明,淫羊藿苷和
4、鹽酸小檗堿對(duì)肝細(xì)胞hepcidin的表達(dá)的增強(qiáng)作用是通過(guò)激活Stat3和Smad1/5/8這兩條主要影響hepcidin表達(dá)的信號(hào)通路完成的。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),淫羊藿苷能增強(qiáng)ICR小鼠肝臟hepcidin的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)從而影響血清和組織中的鐵含量的變化作用得到證實(shí),然而,淫羊藿苷對(duì)小鼠體內(nèi)鐵含量變化的影響在Hepcidin缺乏(Hamp1-/-)的小鼠中并沒(méi)有出現(xiàn),從而進(jìn)一步證明了淫羊藿苷產(chǎn)生作用的靶點(diǎn)為肝臟中的hepcidin。總而言之
5、,淫羊藿苷和鹽酸小檗堿在誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生hepcidin的作用中表現(xiàn)出強(qiáng)大的功效,而這些hepcidin可以用來(lái)抑制膳食中鐵的吸收和促進(jìn)鐵代謝進(jìn)入循環(huán)從而減輕鐵負(fù)荷。這項(xiàng)研究表明某些天然化合物在治療鐵失調(diào)疾病中有很大的應(yīng)用潛力,即可以通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟hepcidin表達(dá)來(lái)治療鐵失調(diào)所產(chǎn)生的疾病。
本課題研究包括以下兩部分:文獻(xiàn)綜述和實(shí)驗(yàn)研究。
1文獻(xiàn)綜述:本部分從“鐵代謝及其影響機(jī)制、相關(guān)疾病和傳統(tǒng)中藥的治療”進(jìn)行綜述。
6、r> 2實(shí)驗(yàn)研究:包括以下五個(gè)部分。
研究一篩選影響hepcidin表達(dá)的中藥單體的干預(yù)效應(yīng)研究。
目的:從14種中藥單體中篩選對(duì)hepcidin表達(dá)有影響的中藥單體。
方法:我們使用熒光素酶標(biāo)記的方法進(jìn)行篩選,這種方法是在我們的研究小組開(kāi)發(fā)的,即構(gòu)建人hepcidin上游的啟動(dòng)子片段(1.6 kb)的螢火蟲熒光素酶基因。在篩選試驗(yàn)進(jìn)行在兩種肝癌細(xì)胞即小鼠的Hepa1-6細(xì)胞和人的HepG2細(xì)胞中同時(shí)進(jìn)行
7、的。篩選前,藥物毒性是評(píng)估通過(guò)MTT法進(jìn)行的,這些天然化合物在濃度不到100μm的時(shí)候沒(méi)有任何細(xì)胞毒性,以淫羊藿苷為代表,我們?cè)诔跏紳舛群Y選試驗(yàn)中選擇使用濃度5μm這個(gè)濃度,各個(gè)中藥單體在這個(gè)濃度下對(duì)細(xì)胞活性都沒(méi)有造成損傷。
結(jié)果:藥物處理后24 h,hepcidin-熒光素酶活性被檢測(cè)。在HepG2細(xì)胞中觀察到相對(duì)于對(duì)照組,桔丙酯,白藜蘆醇,胡黃連苷Ⅱ,小檗堿,淫羊藿苷,土大黃苷和漢黃芩素7組約2倍增加的hepcidin的熒
8、光素酶活性(P<0.05),在HepG2細(xì)胞中相對(duì)于對(duì)照組鹽酸川芎嗪和黃芪甲苷、甘草苷、人參皂苷Rb1這3組發(fā)現(xiàn)hepcidin的熒光素酶報(bào)告基因活性增加了約50%(P<0.05),然而,姜黃素,芍藥苷和阿魏酸未能顯著改變hepcidin的熒光素酶活性(P>0.05)。在Hepa1-6細(xì)胞中,相對(duì)于對(duì)照組,淫羊藿苷,鹽酸小檗堿,胡黃連素Ⅱ,土大黃素和漢黃芩素約2倍的促進(jìn)hepcidin的熒光素酶活性(P<0.05),這個(gè)結(jié)果與在人的肝癌
9、細(xì)胞即HepG2細(xì)胞是一致的。在Hepa1-6細(xì)胞中,相對(duì)于對(duì)照組,阿魏酸、甘草苷、人參皂苷Rb1能刺激hepcidin的熒光素酶的活性增加約50%(P<0.05),其他中藥單體包括白藜蘆醇、桔丙酯、黃芪甲苷、芍藥苷、鹽酸川芎嗪和姜黃素,在Hepa1-6細(xì)胞中與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著改變hepcidin的熒光素酶活性(P>0.05)。
結(jié)論:胡黃連苷Ⅱ;小檗堿;淫羊藿苷;土大黃苷和漢黃芩素這5種不中藥單體能同時(shí)增加在人肝癌細(xì)胞He
10、pG2和鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6細(xì)胞中hepcidin的表達(dá)。
研究二進(jìn)一步用qRT-PCR的方法驗(yàn)證所篩選的中藥單體的效應(yīng)研究。
目的:為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述的篩選出的中藥單體對(duì)hepcidin表達(dá)的影響作用,即是否影響hepcidin內(nèi)源性表達(dá)及可能的劑量依賴的效應(yīng)。
方法:我們用了實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法來(lái)測(cè)定這些中藥單體對(duì)細(xì)胞的hepcidinmRNA水平影響,我們選擇了上述實(shí)驗(yàn)篩選出的淫羊藿苷,鹽酸小
11、檗堿,胡黃連素Ⅱ和土大黃素進(jìn)一步研究。我們使用制造商提供的說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提?。↖nvitrogen公司),mRNA的表達(dá)水平的探討通過(guò)qRT-PCR分析使用2×濃縮的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增的預(yù)混和溶液(SYBR Green qPCR master mix,Qiagen公司)。引物序列如下:人HAMP,上游:5'-CCTGACCAGTGGCTCTGTTT-3',下游:5'-CACATCCCACACTTTGATCG-3';人 GAPD
12、H,上游:5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3',下游:5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3';鼠HAMP,上游:5'-CTGAGCAGCACCACCTATCTC-3',下游:5'-TGGCTCTAGGCTATGTTTTGC-3';鼠GAPDH,上游:5'-AAGGT℃ATCCCAGAGCTG,下游:5'-GCCATGAGGTCCACCACCCT-3';GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)是用來(lái)作為一個(gè)管家基因用
13、來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化相對(duì)的基因表達(dá)。
結(jié)果:通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),淫羊藿苷,鹽酸小檗堿,胡黃連素Ⅱ和土大黃素這4種中藥單體具有顯著提高h(yuǎn)epcidin的熒光素酶活性的作用,然而,在HepG2細(xì)胞中只有淫羊藿苷,鹽酸小檗堿,與土大黃苷被證明與對(duì)照組相比顯著(約2倍)的提高了細(xì)胞內(nèi)源性hepcidin表達(dá)的作用(P<0.05),此外,在Hepa1-6細(xì)胞中,淫羊藿苷和鹽酸小檗堿也被證明與對(duì)照組相比超過(guò)2倍的增加細(xì)胞內(nèi)源性hepcidin表達(dá)(
14、P<0.05),這些數(shù)據(jù)表明,淫羊藿苷和鹽酸小檗堿誘導(dǎo)肝臟hepcidin表達(dá)能力最強(qiáng)。接下來(lái),我們進(jìn)一步驗(yàn)證了淫羊藿苷和小檗堿對(duì)hepcidin表達(dá)的激活作用是否存在劑量依賴的效應(yīng)。在HepG2細(xì)胞中,淫羊藿苷在5μM的濃度下與對(duì)照組相比約2倍增加細(xì)胞中hepcidin表達(dá),在20μM和50μM兩個(gè)濃度下,對(duì)照組相比約3倍增加細(xì)胞中hepcidin表達(dá)(P<0.05)。同樣,在Hepa0-6細(xì)胞中淫羊藿苷從5μM到50μM誘導(dǎo)hepc
15、idin的表達(dá)也存在劑量依賴效應(yīng),與對(duì)照組相比在50μM時(shí)約3倍的最大增加(P<0.05)。與淫羊藿苷相反,鹽酸小檗堿的劑量依賴效應(yīng)并不明顯,它在5μM和50μM兩個(gè)濃度對(duì)HepG2細(xì)胞中hepcidin的表達(dá)的與對(duì)照組相比均大于3倍(P<0.05):類似于HepG2細(xì)胞,鹽酸小檗堿在5μM和50μM兩個(gè)濃度對(duì)Hepa0-6細(xì)胞中hepcidin表達(dá)與對(duì)照組相比升高約有4倍(P<0.05),說(shuō)明鹽酸小檗堿在5μM濃度下就能達(dá)到最大活性并
16、刺激hepcidin的表達(dá)。因此,我們選擇淫羊藿苷和鹽酸小檗堿進(jìn)行接下來(lái)的研究。
結(jié)論:淫羊藿苷和鹽酸小檗堿素進(jìn)一步通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明對(duì)細(xì)胞hepcidin表達(dá)具有刺激作用,因此,我們選擇這兩個(gè)中藥單體進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)研究。
研究三探索淫羊藿苷和鹽酸小檗堿調(diào)節(jié)hepcidin表達(dá)的機(jī)制研究。
目的:為了了解淫羊藿苷和鹽酸小檗堿促進(jìn)hepcidin表達(dá)的分子基礎(chǔ),我們研究了參與Hepcidin表達(dá)
17、調(diào)節(jié)的信號(hào)通路。
方法:我們使用Western blot的方法。即兩種中藥單體作用于細(xì)胞后,細(xì)胞在冷的PBS收獲,總蛋白用RIPA裂解液提取(Solarbio,中國(guó))并添加蛋白酶抑制劑(Roche)。對(duì)每個(gè)樣品的蛋白裂解液等量進(jìn)行SDS-PAGE并按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行Westem blot分析。主要抗體如下,抗-pSmad1/5/8抗體(1∶1000; Santa cruzeBiotechnology),抗-Smadl抗體(1∶1
18、000; Santa cruze Biotechnology),抗-pStat3抗體(1∶1000; Cell Signaling Technology),抗-Stat3抗體(1∶1000; Cell SignalingTechnology)和抗-GAPDH抗體(1∶2000; Sigma-Aldrich)。
結(jié)果:雖然影響hepcidin的調(diào)節(jié)的信號(hào)通路比較復(fù)雜的,但是有兩個(gè)信號(hào)通路被認(rèn)為在正常條件下主要調(diào)控hepcidin
19、的表達(dá),即Stat3通路和Smad1/5/8通路。這兩個(gè)通路中一個(gè)或兩個(gè)被激活,hepcidin表達(dá)可通過(guò)抑制膳食鐵的吸收和巨噬細(xì)胞合成而增多。因此,我們研究了淫羊藿苷和鹽酸小檗堿作用于HepG2細(xì)胞后Stat3通路和Smad1/5/8通路是否被激活。我們觀察到淫羊藿苷作用后Stat3磷酸化水平與對(duì)照組相比明顯增加,特別是在50μM濃度下。同時(shí),觀察到淫羊藿苷作用后磷酸化Smad1/5/8的水平也是增加的,尤其是50μM。這些觀察結(jié)果表
20、明,淫羊藿苷通過(guò)激活Stat3和Smad1/5/8通路增加hepcidin表達(dá),此外,在較高濃度的淫羊藿苷(5μm)比低濃度的能力(在5μm)對(duì)Stat3和Smad1/5/8信號(hào)通路具有更大的激活作用,hepcidin表達(dá)在高濃度也增加更多。類似于淫羊藿苷,鹽酸小檗堿也被證明能激活Stat3信號(hào)通路和Smad1/5/8通路,通過(guò)顯著增加磷酸化Stat3和磷酸化Smad1/5/8證明。鹽酸小檗堿在5μM或50μM兩個(gè)濃度對(duì)磷酸化Smad1
21、/5/8的增加程度是相似的,這與鹽酸小檗堿對(duì)hepcidin誘導(dǎo)的變化在5μM或50μM一致。應(yīng)該指出的是,通過(guò)Westem印跡分析證明淫羊藿苷鹽酸小檗堿不改變總Stat3和Smad1的表達(dá)水平。
結(jié)論:這些結(jié)果表明,淫羊藿苷和鹽酸小檗堿是由于激活Stat3和Smad1/5/8的兩條信號(hào)通而促進(jìn)hepcidin的表達(dá),這兩個(gè)信號(hào)通路共同促進(jìn)肝細(xì)胞hepcidin表達(dá)并響應(yīng)于淫羊藿苷和鹽酸小檗堿作用。
研究四淫羊藿苷對(duì)
22、小鼠體內(nèi)肝臟hepcidin表達(dá)影響的效應(yīng)研究。
目的:為了驗(yàn)證淫羊藿苷的刺激作用,并進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物研究。
方法:野生型(WT) ICR小鼠隨機(jī)分組,每組8只小鼠(n=8)。淫羊藿苷在小鼠腹腔注射的劑量為100mg/kg,對(duì)照組小鼠接受PBS與相應(yīng)濃度的DMSO。對(duì)于急性處理,小鼠在給藥后6h或48h后處死。對(duì)于慢性處理,小鼠分別在給藥后的2d、4d、8d和16d處死小鼠。收集血液,并為每個(gè)小鼠肝臟和脾臟標(biāo)本分離和稱
23、重,一小塊肝標(biāo)本快速冷凍在液氮中,然后保存在-80℃供RNA提取。
結(jié)果:淫羊藿苷和鹽酸小檗堿均能通過(guò)活化的Stat3和Smad1/5/8的途徑促進(jìn)hepcidin的表達(dá),因此,我們只選取淫羊藿苷為下列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致,淫羊藿苷能增強(qiáng)肝臟hepcidin表達(dá),在誘導(dǎo)6h后Hepcidin mRNA表達(dá)水平與未對(duì)照組相比增加約50%(P<0.05),在淫羊藿苷作用后2d,與未處理的小鼠相比對(duì)hepcidin表達(dá)增加
24、約2.5倍(P<0.05,淫羊藿苷對(duì)肝臟hepcidin表達(dá)的刺激作用從4天到16天開(kāi)始減弱。由于肝臟hepcidin的改變,血清鐵也相應(yīng)改變,血清鐵濃度在淫羊藿苷作用6h后與未處理的小鼠相比降低約40%(P<0.05),血清鐵濃度在淫羊藿苷作用后2天與未處理的小鼠相比繼續(xù)減少(P<0.05),血清鐵濃度淫羊藿苷作用后4d至8d仍低于未經(jīng)處理的小鼠,而在16d時(shí),處于未經(jīng)處理的小鼠相類似的水平。淫羊藿苷對(duì)小鼠體內(nèi)血清鐵的影響結(jié)果與肝臟h
25、epcidin表達(dá)的改變相一致,受肝臟hepcidin變化,脾鐵濃度也相應(yīng)發(fā)生了變化,與對(duì)照組相比,總脾鐵從給藥后6h至16天不斷增加(P<0.05)。相比之下,淫羊藿苷隊(duì)總肝鐵的影響并不明顯(P>0.05),這與相對(duì)恒定的肝鐵應(yīng)對(duì)外來(lái)刺激的情況相一致。此外,淫羊藿苷的短期和長(zhǎng)期給藥后小鼠沒(méi)有明顯的肝毒性表現(xiàn)。這個(gè)證據(jù)基于組織學(xué)檢查表明,淫羊藿苷在體內(nèi)給藥的安全性。
結(jié)論:這些結(jié)果共同表明,淫羊藿苷對(duì)調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)hepcidin
26、濃度具有強(qiáng)大的調(diào)節(jié)作用,這種作用能帶來(lái)機(jī)體鐵水平的變化。
研究五;淫羊藿苷對(duì)Hamp1-/-小鼠體內(nèi)鐵含量的影響。
目的:為了證實(shí)我們的發(fā)現(xiàn),淫羊藿苷的功能通過(guò)加強(qiáng)肝臟hepcidin表達(dá)調(diào)節(jié)鐵的平衡。
方法:我們采用了一種新的hepcidin基因敲除小鼠模型,即Hamp1-/-小鼠。Hamp1-/-小鼠在體循環(huán)中不產(chǎn)生功能性的hepcidin,這些小鼠血清和器官存在嚴(yán)重的鐵過(guò)載。為了區(qū)分清楚血清鐵,我們給
27、予這些小鼠在低鐵飲食。在鐵耗盡情況下,我們能夠顯著降低Hamp1-/-小鼠體內(nèi)血清鐵水平。我們將Hamp1-/-小鼠隨機(jī)分組,每組8只小鼠(n=8)。淫羊藿苷在Hamp1-/-小鼠腹腔注射的劑量為100mg/kg,對(duì)照組小鼠接受PBS與相應(yīng)濃度的DMSO,Hamp1-/-小鼠在給藥后48h后處死。
結(jié)果:淫羊藿苷作用于Hamp1-/-小鼠血清鐵水平并沒(méi)有顯著改變,而在WT小鼠中淫羊藿苷在相同濃度和時(shí)間作用后血清鐵明顯降低,即1
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