燒傷后皮膚組織修復(fù)再生的基礎(chǔ)與臨床研究（汗腺再生及燒傷后化膿性肉芽腫診療）.pdf

1、目的:1.探索人外分泌汗腺的自發(fā)熒光發(fā)生機(jī)制;2.篩選與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)轉(zhuǎn)分化為汗腺樣細(xì)胞過程密切相關(guān)基因啟動子位點(diǎn)，探索DNA甲基化調(diào)控MSCs的轉(zhuǎn)分化機(jī)制;3.回顧分析燒傷后化膿性肉芽腫病例特點(diǎn)，比較燒傷后化膿性肉芽腫與經(jīng)典化膿性肉芽腫的不同，優(yōu)化燒傷后化膿性肉茅腫的診斷和治療技術(shù)。
　　方法:1.全厚皮膚組織樣本來自5例志愿者，用熒光顯微鏡觀察人皮膚組織石蠟切片HE染色后外分泌汗腺自發(fā)熒光，并與間接免疫熒光方法

2、比較;提取外分泌汗腺，置于熒光顯微鏡鏡下觀察自發(fā)熒光，采用激光共聚焦掃描顯微鏡測量貼壁后汗腺自發(fā)熒光強(qiáng)度。2.熱休克汗腺誘導(dǎo)MSCs共培養(yǎng)10d，間接免疫熒光技術(shù)檢測MSCs轉(zhuǎn)分化后KRT19和CEA標(biāo)志，用RT-PCR和Western blots檢測誘導(dǎo)MSCs分化0d、5d和10d后CEA基因和蛋白表達(dá)情況。芯片檢測MSCs分化前后45萬個(gè)基因位點(diǎn)DNA甲基化水平變化。從甲基化水平顯著變化基因位點(diǎn)中，篩選出與MSCs轉(zhuǎn)分化密切相關(guān)基

3、因位點(diǎn)。用飛行質(zhì)譜技術(shù)檢測關(guān)鍵基因啟動子的甲基化水平在誘導(dǎo)分化前后的水平變化;篩選出的關(guān)鍵基因構(gòu)建質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染MSCs并培養(yǎng)，分為三組，D組Pax6轉(zhuǎn)染組用MSCs培養(yǎng)基，E組未轉(zhuǎn)染MSCs培養(yǎng)基內(nèi)加入10ng/μL5-Azd，F(xiàn)組Pax6轉(zhuǎn)染MSCs培養(yǎng)基內(nèi)加入10ng/μL5-Azd。應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染5天CEA基因和蛋白表達(dá)。3.收集2003年至2013年燒傷后化膿性肉芽腫患者診治資料，納入標(biāo)準(zhǔn)為資料

4、完整，并且隨訪時(shí)間大于6個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)為資料不完整，或隨訪時(shí)間不足6個(gè)月或者失訪。
　　結(jié)果:1.HE染色后切片存在自發(fā)熒光現(xiàn)象，在藍(lán)光(470/40 nm)下呈現(xiàn)綠色熒光，在綠光(515-560 nm)下呈現(xiàn)紅色熒光，在紫外光(340-380 nm)下呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。這種自發(fā)熒光與間接法免疫熒光比較具有不衰減、操作簡單和成本低的特點(diǎn);游離外分泌汗腺自發(fā)熒光在藍(lán)光(430-500)下表現(xiàn)為綠色，在綠光(500-560nm)下表現(xiàn)為紅

5、色，在紫外光(小于430nm)下表現(xiàn)為藍(lán)色，488nm激光激發(fā)光譜分析有兩個(gè)峰值。一個(gè)峰值位于530nm，熒光強(qiáng)度為11.54±4.66;另一個(gè)位于590nm，熒光強(qiáng)度為10.38±4.33。2.MSC經(jīng)共培養(yǎng)10d后KRT19和和CEA免疫熒光染色示陽性，對照組KRT19和CEA示陰性。芯片檢測MSC誘導(dǎo)分化前后共有76個(gè)基因位點(diǎn)的DNA甲基化水平具有明顯差異(0.169‰)，甲基化水平明顯降低51個(gè)位點(diǎn)，其中SLC12A7、ENKU

6、R、LRWD1、Pax6和HDAC4等位點(diǎn)甲基化水平顯著下降。甲基化水平明顯升高25個(gè)位點(diǎn)，其中Hoxd11、ADARB2、ANGPT1、UNC84A和BMP6等位點(diǎn)DNA甲基化水平明顯升高。提示MSC轉(zhuǎn)分化過程中DNA甲基化水平以下調(diào)為主。經(jīng)過比較分析，選擇Pax6基因位點(diǎn)進(jìn)行飛行質(zhì)譜檢測，結(jié)果提示該位點(diǎn)甲基化水平明顯降低。質(zhì)粒構(gòu)建Pax6轉(zhuǎn)染MSCs，培養(yǎng)5天僅F組CEA基因表達(dá)明顯增高，CEA蛋白陽性表達(dá)。3.本研究納入共15例患

7、者，男女比例為10∶5。年齡范圍自1歲到58歲，均曾有Ⅱ度燒傷。分布于面頸部、軀干和四肢等。保守治療和手術(shù)治療均能治愈PGB。保守治療需要43.9±8.65天，手術(shù)治療患者住院時(shí)間21±2.74天，兩者相比較P＜0.01。11例患者創(chuàng)面培養(yǎng)細(xì)菌或者真菌陽性。10例保守治療自愈。3例全層切除，其中2例切除植皮，1例切除直接縫合。2例刮除手術(shù)。14例患者無復(fù)發(fā)，僅1例刮除手術(shù)后7天復(fù)發(fā)，經(jīng)創(chuàng)面換藥后自愈。
　　結(jié)論:1.外分泌汗腺自發(fā)