DDR1在垂體腺瘤海綿竇侵襲中的作用和機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、垂體腺瘤是一種嚴(yán)重危害人類身心健康的腦良性腫瘤,部份垂體腺瘤具有向周圍結(jié)構(gòu)尤其是海綿竇侵襲的特征。目前侵襲性垂體腺瘤向海綿實(shí)侵犯的機(jī)制尚不清楚,其生物學(xué)特征和組織學(xué)特征相背離的現(xiàn)象令人困惑,難以找到合適的理論和作用機(jī)制來解釋。海綿竇特殊的微環(huán)境可能是腫瘤侵襲的重要因素。細(xì)胞表面受體DDR1具有接受腫瘤微環(huán)境信號(hào),啟動(dòng)磷酸化通路并上調(diào)MMP-2/9表達(dá)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲的能力,可能在垂體腺瘤細(xì)胞和腫瘤的微環(huán)境的相互作用中起到重要作用。

2、 本課題利用基因工程技術(shù),采取真核表達(dá)系統(tǒng)純化出DDR1的可溶性特異競(jìng)爭(zhēng)阻斷蛋白NDDR1。課題以臨床磁共振影像學(xué)為侵襲性判斷標(biāo)準(zhǔn),在大量組織標(biāo)本免疫組化結(jié)果的基礎(chǔ)上,以NDDR1和nilotinib對(duì)原代培養(yǎng)的垂體腺瘤細(xì)胞DDR1進(jìn)行干預(yù)研究,旨在明確垂體腺瘤中DDR1對(duì)MMP-2/9和侵襲能力的調(diào)節(jié)作用,探討DDR1在垂體腺瘤海綿竇侵襲發(fā)病過程中的作用和相關(guān)機(jī)制。 第一部分:DDR1和MMP-2/9在人垂體腺瘤組織中的表

3、達(dá)和相關(guān)性研究 目的：明確DDR1、MMP-2/9在各類型垂體腺瘤組織中的表達(dá)及其同腫瘤生物學(xué)行為的關(guān)系,探討DDR1和M2P-2/9的相關(guān)性。 方法：腫瘤組織標(biāo)本按MRI表現(xiàn)分為侵襲組和非侵襲組,按臨床和免疫組化分為功能性腺瘤組和無功能腺瘤組。共聚焦顯微鏡下觀察DDR1的細(xì)胞定位；免疫組化觀察DDR1和MMP-2/9蛋白的表達(dá)情況；Western blot對(duì)DDR1和MMP-2/9的表達(dá)進(jìn)行半定量分析；同時(shí)采用即時(shí)熒光

4、定量PCR檢測(cè)各組的DDR1、MMP-2/9mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果：1.DDR1表達(dá)于細(xì)胞膜；2.侵襲組中DDR1蛋白和mRNA水平顯著高于非侵襲組(P<0.01),功能性腺瘤組顯著高于無功能腺瘤組(P<0.01);3.侵袋組MMP-2/9蛋白和mRNA水平顯著高于非侵襲組(P<0.01),功能性腺瘤組和無功能腺瘤組無顯著差異(P>0.05);4.DDR1和MMP-2之間有正相關(guān)性(r=0.857,P<0.01),DDR1和M

5、MP-9之間有正相關(guān)性(r=0.813,P<0.01)。 結(jié)論:DDR1和垂體腺瘤的侵襲性有關(guān)；DDR1可能通過上調(diào)MMP-2/9的表達(dá),從而增強(qiáng)垂體腺瘤的侵襲性。 第二部分：重組DDR1競(jìng)爭(zhēng)阻斷蛋白(NDDR1)的制備和活性鑒定 目的：制備DDR1的可溶性特異競(jìng)爭(zhēng)阻斷蛋白(NDDR1);對(duì)重組NDDR1進(jìn)行活性鑒定,確定其阻斷垂體腺瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞DDR1的量效關(guān)系。 方法：擴(kuò)增DDR1胞外區(qū),構(gòu)建真核表

6、達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-NDDR1,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,純化獲得NDDR1蛋白；ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NDDR1的生物學(xué)活性,確定阻斷垂體腺瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞DDR1的最佳劑量。 結(jié)果：1.獲得哺乳動(dòng)物系統(tǒng)表達(dá)和純化的NDDR1蛋白3mg/L；2.競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)示NDDR1具有可競(jìng)爭(zhēng)阻斷細(xì)胞表面天然DDR1受體的能力；3.2μg/L的NDDR1即可阻斷原代培養(yǎng)的垂體腺瘤DDR1。 結(jié)論：可溶性競(jìng)爭(zhēng)阻斷蛋白NDDR1可特異性

7、阻斷原代培養(yǎng)的垂體腺瘤DDR1受體。 第三部份原代培養(yǎng)細(xì)胞中膠原I-DDR1-MMP-2/9環(huán)路的激活 目的：確定垂體腺瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞中誘發(fā)DDR1信號(hào)通路的膠原類型,研究啟動(dòng)DDR1信號(hào)通路后Tyr磷酸化水平的變化,探討細(xì)胞水平DDR1調(diào)節(jié)MMP-2/9表達(dá)的作用,體外論證垂體腺瘤海綿竇侵襲中膠原I-DDR1-MMP-2/9環(huán)路的激活過程。 方法：原代培養(yǎng)垂體腺瘤細(xì)胞中,給予外源性膠原Ⅰ、膠原Ⅱ、膠原Ⅲ、膠原Ⅳ

8、刺激,細(xì)胞上清液行ELISA法以確定誘發(fā)DDR1信號(hào)通路的膠原類型；免疫沉淀法測(cè)定NDDR1和nilotinib干預(yù)前后Tyr磷酸化水平：明膠酶譜法和ELISA法測(cè)量刺激和阻斷DDR1信號(hào)通路后MMP-2/9活性和表達(dá)水平的變化情況；建立Transwell侵襲模型小室,鏡下計(jì)數(shù)觀察NDDR1和nilotinib干預(yù)前后細(xì)胞侵襲能力的變化。 結(jié)果：成功對(duì)9例垂體腺瘤進(jìn)行原代培養(yǎng)。1.膠原I是激發(fā)垂體腺瘤DDR1信號(hào)通路的主要膠原類

9、型；2.膠原I刺激后Tyr磷酸化水平明顯升高(P<0.05),NDDR1和nilotinib可抑制自磷酸化；3.膠原I刺激后顯著提高M(jìn)MP-2/9的表達(dá)(P<0.05),NDDR1和nilotinib可抑制該效應(yīng)；4.NDDR1和nilotinib干預(yù)后細(xì)胞侵襲能力下降(P<0.05)。 結(jié)論：膠原I通過誘發(fā)DDR1的磷酸化上調(diào)MMP-2/9的表達(dá),從而增強(qiáng)垂體腺瘤的侵襲能力,阻斷DDR1可有效降低腫瘤的侵襲性；體外證實(shí)了膠原I