卵巢癌相關(guān)抗原CA125膠體金免疫層析檢測(cè)方法的初步建立.pdf

1、卵巢癌是女性生殖器最常見(jiàn)的三大惡性腫瘤之一，因其發(fā)病初期無(wú)典型臨床癥狀，多數(shù)患者就診時(shí)已處于患病晚期。因此，如何在卵巢癌發(fā)病早期準(zhǔn)確診斷就顯得尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，糖類(lèi)抗原125（Carbohydrate antigen125，CA125）作為婦科臨床最常用的血清型腫瘤標(biāo)志物，對(duì)上皮性卵巢癌具有一定的特異性和敏感性，在卵巢癌的預(yù)防、輔助診斷、病情評(píng)估以及術(shù)后療效等方面具有非常積極的意義，可作為卵巢癌防治的主要監(jiān)測(cè)指標(biāo)。目前CA125的檢測(cè)

2、技術(shù)主要有化學(xué)發(fā)光法及酶聯(lián)免疫法等，所使用的檢測(cè)試劑盒大多為昂貴的進(jìn)口或國(guó)內(nèi)分裝試劑，且檢測(cè)時(shí)均需依賴相關(guān)檢測(cè)儀器在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，檢測(cè)成本較高，不適合于基層醫(yī)院進(jìn)行大規(guī)模初篩和床旁快檢。因此，急需尋找一種簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)技術(shù)，為臨床診斷提供依據(jù)。
　　本研究采用正辛酸-硫酸銨沉淀法純化CA125包被和標(biāo)記單克隆抗體，經(jīng)透析后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定280nm處吸光值，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算出兩種抗體的蛋白濃度，再通過(guò)SDS-PAGE對(duì)兩株抗體

3、進(jìn)行純度鑒定。采用檸檬酸三鈉還原法并控制檸檬酸三鈉加入量的不同而制備不同粒徑的膠體金，對(duì)其最適粒徑、膠體金制備工藝、標(biāo)記pH、最佳標(biāo)記蛋白量、金標(biāo)稀釋液加入量、硝酸纖維素膜、樣品墊處理液、劃膜液和最佳包被抗體量等因素進(jìn)行選擇優(yōu)化，并對(duì)試紙條的穩(wěn)定性、特異性、靈敏度進(jìn)行性能研究及實(shí)驗(yàn)室臨床標(biāo)本評(píng)價(jià)，制備出能快速檢測(cè)人血清中CA125的膠體金檢測(cè)試紙。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，純化后獲得的抗體純度較高，其中每3mL抗體腹水純化后獲得1mLC

4、A125包被抗體，濃度為14.93mg/mL，1.15mL標(biāo)記抗體，濃度為15.08mg/mL。采用的24.5nm膠體金顆粒相對(duì)均一，且性能穩(wěn)定。膠體金制備的最優(yōu)工藝為:加熱至沸騰時(shí)間8min，200rpm最大轉(zhuǎn)速，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5min。通過(guò)反應(yīng)模式優(yōu)化，建立了膠體金檢測(cè)試紙條工藝:膠體金與蛋白標(biāo)記pH為7.5，標(biāo)記蛋白濃度為1.4mg/mL，金標(biāo)稀釋液加入量為300μL/mL，NC膜選用TEST NC膜，樣品墊處理液最佳配方組合

5、為0.03MpH8.8 Tris、0.3％Tween-20、0.5％pvp、0.3％檸檬酸，質(zhì)控線和檢測(cè)線包被蛋白濃度1.5mg/mL，以此方法建立的試紙條靈敏度為35U/mL，且不與CEA、AFP、CA50、CA15-3、CA19-9發(fā)生交叉反應(yīng)，37℃加速破壞實(shí)驗(yàn)21d后顯示該試紙條穩(wěn)定性良好。臨床評(píng)價(jià)結(jié)果顯示:200份臨床標(biāo)本的檢測(cè)陽(yáng)性符合率100/100，陰性符合率98/100。
　　本研究成功建立了CA125膠體金免疫層