重組hTAZ慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1分化的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建人真核表達(dá)的hTAZ慢病毒載體pLenti6/V5-hTAZ，轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞獲得重組慢病毒顆粒，研究hTAZ對(duì)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1分化的調(diào)控作用。
　　方法：將已經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證的，含有hTAZ基因慢病毒入門質(zhì)粒pENTR221-hTAZ通過LR反應(yīng)克隆到慢病毒載體pLenti6/V5-DEST中。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定并在細(xì)胞中驗(yàn)證表達(dá)。將該重組載體和慢病毒包裝質(zhì)粒充分混合，用陽離子脂質(zhì)體Lipofactamin

2、e轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，培養(yǎng)和待細(xì)胞完全裂解后收集富含hTAZ基因的慢病毒顆粒上清液，取適量上清液感染MC3T3-E1細(xì)胞，采用殺稻瘟菌素（Blastcidin）篩選，建立了穩(wěn)定過量表達(dá)hTAZ蛋白的MC3T3-E1/hTAZ細(xì)胞系。用條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)MC3T3-E1和MC3T3-E1/hTAZ細(xì)胞成骨、成脂分化，vonKossa和茜素紅染色比較MC3T3-E1和MC3T3-E1/hTAZ成骨分化程度差異；油紅O染色比較其成脂分化差異，考察

3、hTAZ基因過表達(dá)對(duì)前成骨細(xì)胞分化的影響。
　　結(jié)果：凝膠電泳和測(cè)序結(jié)果均證明hTAZ重組慢病毒載體pLenti6/V5-hTAZ構(gòu)建正確，并能在細(xì)胞中正確表達(dá)。與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)包裝細(xì)胞獲得慢病毒顆粒，并成功感染MC3T3-E1細(xì)胞。vonKossa染色和茜素紅染色結(jié)果表明，MC3T3-E1/hTAZ細(xì)胞成骨分化強(qiáng)于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，而其成脂分化受抑制。
　　結(jié)論：本研究構(gòu)建了人真核表達(dá)的質(zhì)粒載體pLenti6/V5-hTAZ，并能