利用SSR和RAPD技術(shù)構(gòu)建柑桔分子遺傳圖譜.pdf

1、本研究以清見(jiàn)桔橙(C.reticulata×C.sinensis)(母本)與強(qiáng)德勒柚(C.grandisOsb)(父本)的F1代102株為作圖材料，利用SSR和RAPD兩種標(biāo)記，圍繞柑桔分子遺傳圖譜的構(gòu)建，進(jìn)行了柑桔基因組DNA提取方法的改進(jìn)、適用于柑桔的SSR標(biāo)記體系的建立以及SSR和RAPD標(biāo)記的分離分析等方面研究，并最終構(gòu)建了柑桔分子遺傳圖譜。主要結(jié)果如下： 1、適合SSR分析和RAPD分析的柑桔基因組DNA提取方法在CT

2、AB溶液中加入抗氧化劑1﹪PVP和0.2﹪β-巰基乙醇，提取的DNA粗提物呈無(wú)色透明狀，沒(méi)有褐化現(xiàn)象。 用不同生長(zhǎng)期的材料提取柑桔基因組DNA，幼葉提取的基因組DNA質(zhì)量最好，得率最高。2、適合遺傳圖譜構(gòu)建的SSR標(biāo)記技術(shù)的建立通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度和反應(yīng)體系等參數(shù)，篩選多態(tài)性豐富的SSR引物，建立了適合構(gòu)建柑桔遺傳圖譜的SSR分析技術(shù)：柑桔SSR分析的PCR反應(yīng)體系以20μL為宜，含10×Buffer2.0μL，25mM

3、MgCl21.6μL，2.5mMdNTP1.6μL，15ng/μlPrimer各1.0μL，5U/μLTaq聚合酶0.2μL，模模板DNA(50ng/μL)1.0μL；各引物復(fù)性溫度梯度試驗(yàn)結(jié)果表明，所篩選的28對(duì)SSR引物的最佳復(fù)性溫度在54℃到58℃之間。 從75對(duì)SSR引物中篩選獲得在雙親間存在多態(tài)性的引物28對(duì)，多態(tài)性比例為37.33﹪，這些引物適合用于構(gòu)建柑桔遺傳圖譜的SSR分析。 3、作圖群體SSR分析用篩選

4、出的28對(duì)引物對(duì)F1群體進(jìn)行SSR分析，共獲得穩(wěn)定、至少可重復(fù)1次的多態(tài)性帶型59條，平均每對(duì)引物可產(chǎn)生2.1條多態(tài)性條帶。經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn)，獲得的59個(gè)SSR多態(tài)性位點(diǎn)中，有34個(gè)位點(diǎn)符合孟德?tīng)柗蛛x比例(1∶1)，可用于構(gòu)建分子遺傳圖譜；其余25個(gè)位點(diǎn)因不符合孟德?tīng)柗蛛x比例而不能用于作圖。 4、作圖群體RAPD分析從20個(gè)RAPD隨機(jī)引物中篩選獲得在雙親間存在多態(tài)性的引物8個(gè)，多態(tài)性比例為40﹪。用篩選出的8個(gè)隨機(jī)引物對(duì)F1群體進(jìn)行

5、多態(tài)性分析，共獲得穩(wěn)定、至少可重復(fù)1次的多態(tài)性帶型21個(gè)，平均每個(gè)引物可產(chǎn)生2.64條多態(tài)性條帶。經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn)，獲得的21個(gè)RAPD多態(tài)性位點(diǎn)中，有11個(gè)位點(diǎn)符合孟德?tīng)柗蛛x比例(1∶1)，可用于作圖；其余10個(gè)位點(diǎn)因不符合孟德?tīng)柗蛛x比例而不能用于作圖。 5、柑桔分子遺傳圖譜的構(gòu)建利用SSR和RAPD標(biāo)記構(gòu)建了一張包含11個(gè)連鎖群，由45個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)組成的柑桔(2n=18)分子遺傳圖譜，其中包括34個(gè)SSR標(biāo)記，11個(gè)RAPD標(biāo)記，圖