苦參堿對HepG-,2-細(xì)胞增殖與c-myc、bcl-2等相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、苦參堿(matrine)作為我國傳統(tǒng)中藥苦參(Sophora.flavescens Ait.)的主要有效成份，具有廣泛而顯著的抗腫瘤活性。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，苦參堿可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其向正常細(xì)胞分化，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，但因其作用途徑十分復(fù)雜，機(jī)制至今仍不明確。本研究以人肝癌細(xì)胞株HepG2為對象，研究苦參堿抗肝癌作用及機(jī)理。 1.依據(jù)組合正交試驗(yàn)方案L<,18>(2<'1>×3<'7>)，我們選擇培養(yǎng)基、細(xì)胞接種密度、血清含量、

2、雙抗?jié)舛?、pH值、胰蛋白酶濃度、Hank's液清洗次數(shù)、消化時間八個因素，其中培養(yǎng)基因素分為二個水平，其余每因素分三個水平。制備4×10<'4>個/mL細(xì)胞懸液并培養(yǎng)1～10d，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞計數(shù)法測定細(xì)胞生長曲線及細(xì)胞分裂指數(shù)。結(jié)果表明，HepG<,2>細(xì)胞體外培養(yǎng)最佳條件為：含15％FBS的DMEM培養(yǎng)基，接種密度為4×10<'4>個/mL,0.5％雙抗，pH 7.2；匯合度達(dá)95％～100％時，Hank's洗三次，0.

3、05％胰酶.EDTA消化1min。 2.設(shè)10個苦參堿實(shí)驗(yàn)組，使其終濃度分別為0.2、0.3、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5g/L；另設(shè)PBS對照組。制備4×10<'4>個/mL細(xì)胞懸液并培養(yǎng)1～4d，光鏡下分別觀察活細(xì)胞及HE染色細(xì)胞形態(tài)；細(xì)胞計數(shù)法測定實(shí)驗(yàn)組HepG<,2>細(xì)胞生長曲線及細(xì)胞分裂指數(shù)；MTT法檢測苦參堿對實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的抑制率。另設(shè)9個苦參堿實(shí)驗(yàn)組，使其終濃度分別為0.1、0.15

4、、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5g/L，MTT法測定抑制率。結(jié)果顯示，苦參堿濃度小于0.2g/L時，對HepG<,2>細(xì)胞的增殖呈負(fù)抑制作用；大于0.3g/L時，呈正向抑制作用，且隨作用時間的延長與劑量的增加，苦參堿對HepG<,2>細(xì)胞抑制率升高，其作用階段表現(xiàn)為：0.3～0.8g/L抑制細(xì)胞生長；0.8～1.5g/L誘導(dǎo)細(xì)胞分化；大于1.5g/L誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；達(dá)2.5～3.5g/L致部分細(xì)胞壞死。

5、 3.設(shè)9個苦參堿實(shí)驗(yàn)組，使其終濃度為0.3、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5g/L；另設(shè)PBS對照組。制備4×10<'4>個/mL細(xì)胞懸液并培養(yǎng)3d，通過SABC免疫組化方法檢測苦參堿對用藥前后HepG<,2>細(xì)胞增殖相關(guān)因素AFP和PCNA的影響，以及。HepG<,2>細(xì)胞分化、凋亡相關(guān)基因c-myc、bcl.2和bax的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞AFP、PCNA、C-myc和Bcl-2均為不

6、同程度陽性，免疫組化胞漿或胞核呈棕黃色：Bax表達(dá)呈陰性，免疫組化不顯色。與對照組細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Bax陽性增強(qiáng)，胞漿呈淡黃色；其它蛋白陽性程度均不同程度減弱，胞漿或胞核呈淡黃色。 本研究表明，低濃度苦參堿對HepG<,2>細(xì)胞有一定的負(fù)抑制作用；濃度大于0.3g/L的苦參堿可抑制HepG<,2>細(xì)胞增殖，使部分惡性增殖表型減弱或消失，其抑制作用呈時間和劑量依賴性；而誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡可能主要是通過抑制AFP、PCNA、c-