G蛋白抑制肽GCIP對自發(fā)性高血壓大鼠心室重構(gòu)影響及其藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、高血壓病是遺傳和環(huán)境等多種因素所致的全球性常見病和多發(fā)病。近20多年來，隨著社會經(jīng)濟(jì)狀況的改善和人民生活方式的轉(zhuǎn)變，高血壓的發(fā)病率呈逐年增加趨勢；如果高血壓長期不治療，會引起心、腦、腎等重要臟器的損害，如腦卒中，心肌梗死，充血性心衰及腎衰等。左室肥厚是高血壓主要的靶器官損害之一，可以引起心臟順應(yīng)性以及收縮和舒張功能的下降，并最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生。心肌肥厚與重構(gòu)是引起心血管疾病發(fā)生率和死亡率顯著升高的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。心室重構(gòu)特點(diǎn)為心肌細(xì)

2、胞肥大，間質(zhì)纖維化及左室重量、形狀、結(jié)構(gòu)及功能的改變。高血壓導(dǎo)致的左心室肥厚、心肌纖維化及冠脈結(jié)構(gòu)異常即心室重構(gòu)，是高血壓患者心血管事件發(fā)生與死亡的主要病理基礎(chǔ)?？垢哐獕褐委煵粌H應(yīng)有效控制血壓，更應(yīng)有效抑制和逆轉(zhuǎn)其心血管結(jié)構(gòu)和功能異常，以減少心血管事件的發(fā)生率。 G蛋白在高血壓及心血管重構(gòu)的形成發(fā)展過程中扮演著非常重要的角色，在多種因素誘發(fā)心肌肥大的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，G蛋白處于樞紐地位，針對G蛋白設(shè)計(jì)特異性阻止心肌肥大發(fā)生發(fā)展

3、的藥物可能具有更強(qiáng)的作用。GCIP(Gproteincompetitiveinhibitorypeptide)是由我室針對在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用的G蛋白α亞單位克隆制備出的一種G蛋白競爭性抑制肽，對體外培養(yǎng)的去甲腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞肥大具有較好的抑制作用。GCIP-27是在GCIP基礎(chǔ)上經(jīng)分子優(yōu)化制備出的一種GCIP的衍生肽，能夠抑制由AngⅡ、NE等誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的肥大和增生；在多種心肌肥厚模型上具有良好的抗心肌肥

4、大作用；并對自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneoushypertensiverat，SHR)的血管重構(gòu)有良好的抑制作用。 本實(shí)驗(yàn)以自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)為研究對象，采用多普勒超聲心動(dòng)圖及無創(chuàng)尾套法，系統(tǒng)評價(jià)GCIP-27對SHR心室重構(gòu)及血壓的影響；采用RT-PCR法從分子水平初步探究其抗心室重構(gòu)的作用機(jī)制；并用同位素標(biāo)記示蹤法觀察了GCIP-27在動(dòng)物體內(nèi)的分布、排泄、代謝過程，獲得藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為其以后研發(fā)及應(yīng)用奠定基

5、礎(chǔ)。 方法： 1.用SHR作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，給予GCIP-27(10、30、90μg.kg-1，i.p.，bid)或氯沙坦(6mg.kg-1，ig，o.d.)治療8周，并設(shè)立Wistar大鼠正常對照。通過如下方法評價(jià)GCIP-27對大鼠心室重構(gòu)及血壓的影響：①大鼠血壓的測定采用無創(chuàng)尾套法；②超聲心動(dòng)圖評價(jià)大鼠的左心室結(jié)構(gòu)和心功能：③心肥厚指數(shù)及心肌間質(zhì)膠原含量的測定評價(jià)大鼠的心室肥厚程度；④HE染色，光鏡下觀察大鼠心肌組

6、織形態(tài)學(xué)改變；VG染色，對大鼠心肌膠原進(jìn)行定性及半定量分析；透射電鏡觀察大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。 2.采用RT-PCR法檢測大鼠心肌ANPmRNA、BNPmRNA、α-MHCmRNA、β-MHCmRNA的表達(dá)；放射免疫分析法測定心肌細(xì)胞磷脂酶C(PLC)活性。 3.采用同位素標(biāo)記示蹤法，結(jié)合三氯乙酸(TCA)沉淀法及低分子量SDS-PAGE法，對GCIP-27進(jìn)行了藥代動(dòng)力學(xué)研究。 結(jié)果： 1.GCI

7、P-27對SHR血壓的影響SHR的收縮壓顯著高于正常組，10、30、90μg.kg-1的GCIP-27治療8周后均能明顯降低SHR的收縮壓(p＜0.01)，但其降壓效果遠(yuǎn)不如6mg.kg-1的氯沙坦，90μg.kg-1的GCIP-27降壓效果僅為后者的60.6％。 2.GCIP-27對SHR心室重構(gòu)的影響 (1)SHR模型組大鼠有明顯的心室重構(gòu)現(xiàn)象，與正常組相比，模型組大鼠左室后壁厚度(PWT)、室間隔厚度(IVST)、

8、心肌肥厚指數(shù)(LVMI)、心肌膠原含量、心肌間質(zhì)膠原面積(CA)、及膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)明顯增高(p＜0.01)；經(jīng)治療8周后，GCIP-27(10、30、90μg.kg-1)均能顯著減少(p＜0.05)大鼠的PWT、IVST、LVMI、CA、CVF及膠原含量；氯沙坦也能降低除LVMI之外的上述指標(biāo)(p＜0.05)，但降低程度不及GCIP-27顯著。 (2)病理及電鏡： ①SHR模型組大鼠心肌組織形態(tài)及心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

9、嚴(yán)重受損，光鏡下可見心肌細(xì)胞明顯濁腫，空泡樣變化；細(xì)胞核肥大或固縮；細(xì)胞內(nèi)容物成顆粒狀，斷裂融合；可見到壞死灶。VG染色可見模型組SHR大鼠心肌膠原分布較多。電鏡下可見心肌細(xì)胞腫大，核肥大、畸形、溶解等呈不規(guī)則變化；肌漿網(wǎng)擴(kuò)張；線粒體增生明顯，排列紊亂，不同程度(輕、中、重)腫脹，內(nèi)有空泡形成。 ②GCIP-27(90μg.kg-1)能明顯改善上述病理改變及心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，心肌組織形態(tài)及心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)基本正常。 ③G

10、CIP-27(10、30μg.kg-1)和氯沙坦組大鼠心肌病理改變及超微結(jié)構(gòu)有所改善，但改善不明顯，個(gè)別視野仍可見到壞死灶。 3.GCIP-27抗心室重構(gòu)作用機(jī)制的研究 (1)SHR模型組大鼠心肌ANPmRNA、BNPmRNA、β-MHCmRNA的表達(dá)均顯著增加及α-MHCmRNA表達(dá)減少；治療8周后，GCIP-27(10、30、90μg.kg-1)及氯沙坦均能降低ANPmRNA、BNPmRNA、β-MHCmRNA的表達(dá)

11、及增加α-MHCmRNA的表達(dá)。 (2)模型組大鼠左心室心肌細(xì)胞PLC活性顯著增加(p＜0.01)；治療8周后，GCIP-27(10、30、90μg.kg-1)大鼠心肌細(xì)胞PLC活性顯著降低(p＜0.01)；氯沙坦也顯著降低SHR大鼠左室心肌細(xì)胞PLC活性(p＜0.01)，相當(dāng)于GCIP-27低劑量(10μg.kg-1)的療效。 4.GCIP-27在動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究 (1)血藥濃度的測定血藥濃度-時(shí)間曲線

12、數(shù)據(jù)經(jīng)DAS2.0藥代動(dòng)力學(xué)統(tǒng)計(jì)程序擬合，求出有關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)為：在3.75-480ng.ml-1劑量范圍內(nèi)，GCIP-27在小鼠體內(nèi)按一級動(dòng)力學(xué)代謝，并呈三室開放模型。靜注125Ⅰ-GCIP-2790μg·kg-1，電泳法和酸沉法測得t1/2α、t1/2β、t1/2γ分別為0.009h、0.245h、2.054h和0.025h、0.306h、2.323h；達(dá)峰時(shí)間tmax均為0.0333h，平均血漿清除率(cl)分別為0.295L·

13、h-1·kg-1、0.322L·h-1·kg-1，表觀分布容積(Vd)分別為0.559L·kg-1、1.29L·kg-1，體內(nèi)平均滯留時(shí)間(MRT)分別為2.353h、2.515h。 (2)GCIP-27在小鼠體內(nèi)的分布GCIP-27在小鼠體內(nèi)分布廣泛，其中心、血管、腎、胃、肺、小腸等組織分布較高，肌肉、脂肪等組織相對較低，腦最低。 (3)GCIP-27在動(dòng)物體內(nèi)的排泄大鼠72h尿、糞、膽汁原形藥物排泄量分別為給藥量的2

14、6.13％，0.95％和4.12％，72h總排泄量為31.21％。小鼠72h尿、糞原形藥物排泄量分別為給藥量的27.92％，0.84％，72h總排泄量為28.76％。GCIP-27主要經(jīng)尿液排泄，少量經(jīng)膽汁排泄，少許經(jīng)糞便排泄，提示腎是GCIP-27的主要排泄器官。 結(jié)論： 1.GCIP-27具有良好的抗SHR心室重構(gòu)作用，及較明顯降低SHR血壓的效應(yīng)，且呈劑量依賴關(guān)系。 2.GCIP-27改善心室重構(gòu)作用明顯優(yōu)

15、于氯沙坦，90μg/kg的GCIP-27，劑量僅為氯沙坦(6mg/kg)的1/67，其降低大鼠的PWT、IVST、LVMI分別為氯沙坦的1.6倍、2.7倍、3.2倍；但其降壓效果僅為后者的60.6％。因此，GCIP-27改善心室重構(gòu)的作用并非完全依賴于血壓的降低，而有較高的選擇性和特異性。 3.GCIP-27改善心室重構(gòu)的作用機(jī)制與降低心肌細(xì)胞磷脂酶C(PLC)活性，以及抑制大鼠心肌ANPmRNA、BNPmRNA、β-MHCmR