肝素抑制LDL受體基因敲除小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達(dá)及抗動脈粥樣硬化形成作用.pdf

1、背景： 肝素通過與抗凝血酶Ⅲ結(jié)合，顯示強(qiáng)大的抗凝血作用，臨床上作為特異的抗凝血藥物目前主要用于血栓栓塞性疾病的預(yù)防和治療。多項(xiàng)研究顯示肝素還具有抗動脈粥樣硬化作用，但是其具體機(jī)制尚不清楚。我們前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞水平肝素能夠抑制高同型半胱氨酸誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達(dá)。基質(zhì)金屬蛋白酶-2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族一員，可降解完整的Ⅳ型基底膜膠原與變性的Ⅰ、Ⅲ型膠原及彈性蛋白，對動脈粥樣硬化病理過程中平滑肌細(xì)胞的遷移和增

2、殖起重要作用。通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達(dá)可能是肝素抗動脈粥樣硬化的機(jī)制之一。肝素在活體水平是否抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)尚未進(jìn)行過研究。 目的： 探討肝素對低密度脂蛋白受體基因敲除小鼠動脈粥樣硬化形成及粥樣硬化斑塊內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)的影響。 方法： 以24只7周齡低密度脂蛋白受體基因敲除小鼠為研究對象，1周適應(yīng)期后隨機(jī)分成三組，一組給予正常飲食(n=8)，一組給予高脂+高蛋氨酸飲食同時予無菌注

3、射液(1ml/kg*天，n=8)皮下注射作為對照組，一組給予高脂+高蛋氨酸飲食同時予肝素皮下注射(1500U/kg*天，n=8)作為實(shí)驗(yàn)組。喂養(yǎng)12周后，采用乙醚麻醉小鼠，解剖暴露胸腔后采用無菌注射器經(jīng)右心室采血，離心后以酶法對血清中總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯在abbott-AEROSET全自動生化分析儀上進(jìn)行檢測，以免疫競爭法對血清同型半胱氨酸水平在ADVIA全自動免疫分析儀上進(jìn)行檢測；采用10％甲醛溶液于左心室灌流固定主

4、動脈后，自腎動脈分支將主動脈和心臟整體取下于甲醛溶液固定24小時。主動脈及心臟標(biāo)本固定后放置于體視顯微鏡下，于頭臂干分支上方2mm處將主動脈弓和胸、腹主動脈同升主動脈(含主動脈竇部)分離。沿縱軸方向?qū)⒅鲃用}弓和胸、腹主動脈解剖開，采用蘇丹Ⅳ對其染色，于體視顯微鏡下展開拍照，借助Image pro-plus6.0圖像分析軟件測定動脈內(nèi)膜面粥樣硬化面積。主動脈竇部石蠟包埋后行連續(xù)切片，每只小鼠主動脈竇部標(biāo)本取5張切片行HE染色，采用LEIC

5、A DC3000照相機(jī)拍照，借助圖像分析軟件測定每張切片粥樣硬化面積；取1張連續(xù)切片采用免疫組織化學(xué)方法對竇部斑塊內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-2進(jìn)行染色檢測并拍照，借助圖像分析軟件測定每張切片基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)陽性區(qū)面積。 結(jié)果： 普通飲食組、對照組和肝素組血清總膽固醇水平分別為649.48±37.04，1553.53±51.53和1248.28±57.07mg/dl，三組之間差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，與對照組相比肝

6、素組總膽固醇減低19.6％；三組高密度脂蛋白膽固醇水平分別為47.56±1.29，95.13±2.49和111.03±3.32mg/dl，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，與對照組相比肝素組升高16.7％；三組血清甘油三酯水平分別為113.78±3.97，205.28±10.23和203.61±11.84mg/dl，肝素組同對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.90)，正常飲食組較兩組均減低(P均<0.001)；三組同型半胱氨酸

7、水平分別為6.9±0.51，21.86±0.53和22.53±0.66μmol/L，肝素組同對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.42)，正常飲食組較兩組均低(P均<0.001)。12周喂養(yǎng)后，正常飲食組主動脈內(nèi)膜面和竇部均無粥樣硬化形成，高脂+高蛋氨酸飲食的實(shí)驗(yàn)組和對照組主動脈內(nèi)膜面和竇部均出現(xiàn)動脈粥樣硬化；與對照組相比，肝素干預(yù)組主動脈內(nèi)膜面粥樣硬化面積減少40.5％(P<0.001)；主動脈竇部粥樣硬化面積與對照組相比也明顯減少(1

8、60648±5482和192729±10680μ㎡，P<0.05)。同粥樣硬化改變一致，肝素干預(yù)組主動脈竇部粥樣硬化斑塊內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-2的陽性區(qū)面積較對照組減少49.3％(P<0.001)。 結(jié)論： 給予高脂+高蛋氨酸飲食12周，低密度脂蛋白受體基因敲除小鼠可形成動脈粥樣硬化。適量的肝素干預(yù)能減輕動脈粥樣硬化，并抑制粥樣硬化斑塊內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)。這提示肝素具有抗動脈粥樣硬化形成作用；通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2