基因工程融合蛋白疫苗的衍生化及肝癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的建立與鑒定.pdf

1、腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的生物學(xué)特征之一，也是腫瘤臨床治療的難點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，60％以上的惡性腫瘤患者于初次診斷時(shí)已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移[1]。在臨床腫瘤患者中，約有80％-90％以上死于侵襲和轉(zhuǎn)移，可以說(shuō)腫瘤轉(zhuǎn)移是大多數(shù)腫瘤患者死亡的主要原因。肝細(xì)胞癌由于其組織結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，容易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，是肝癌預(yù)后不良的原因之一。在肝細(xì)胞肝癌患者尸檢中發(fā)現(xiàn)50％-84.6％有轉(zhuǎn)移[2]。目前肝癌的治療手段主要有手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、中醫(yī)藥治療等。隨著對(duì)腫瘤免疫理

2、論的深入認(rèn)識(shí)和一些新的實(shí)驗(yàn)方法的涌現(xiàn)，腫瘤疫苗已成為預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的得力手段。黑色素瘤抗原(MelanomaAntigen，MAGE)是最先被發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤特異性抗原，1991年Boon等首次發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤免疫排斥抗原－黑色素瘤相關(guān)抗原-1(Melanomaassociatedantigen-1,MAGE-1)是MAGE家族的組成成員。其廣泛表達(dá)于多種不同組織類型的腫瘤，而在除睪丸和胎盤外的正常組織中均不表達(dá)；又因MAGE-1

3、可與人類白細(xì)胞抗原(HumanLeukocytesAntigen，HLA)分子形成抗原復(fù)合物，此抗原復(fù)合物可被細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CytotoxicLymphocyte，CTL)的T細(xì)胞受體(Tcellreceptor，TCR)所識(shí)別，刺激強(qiáng)烈的CTL反應(yīng)[3]，因此其是腫瘤特異性免疫治療理想的靶分子。熱休克蛋白(HeatShockProtein,HSP)具有分子伴侶作用，參與腫瘤抗原的加工遞呈，在誘導(dǎo)腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)

4、室研究已經(jīng)表明，HSP70與MAGE1融合蛋白能提高M(jìn)AGE1蛋白疫苗的免疫效果。
　　為了給MAGE1與HSP70融合蛋白基因工程納米疫苗在預(yù)防肝癌轉(zhuǎn)移方面提供合適的動(dòng)物模型，本研究主要用人外周血淋巴細(xì)胞(Humanperipheralbloodlymphocyte,huPBL)和肝癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞系97-高轉(zhuǎn)移(Metastatichepatocellularcarcinomacell97-High,MHCC97-H)建立免疫重建荷

5、人高轉(zhuǎn)移肝癌重癥聯(lián)合免疫缺陷（Severecombinedimmunodeficiency，SCID）小鼠模型，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。全文分為以下三個(gè)部分：
　　實(shí)驗(yàn)一：MHCC97-Ｈ細(xì)胞中MAGE-1抗原表達(dá)的檢測(cè)
　　目的：檢測(cè)MHCC97-H細(xì)胞中MAGE-1抗原的表達(dá)情況，為MAGE-1/HSP70融合蛋白基因工程納米疫苗預(yù)防肝癌實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。方法：用免疫組化、免疫熒光、WesternBlotting來(lái)檢測(cè)MHCC97-

6、H細(xì)胞中MAGE-1的表達(dá)情況。結(jié)果：檢測(cè)出MHCC97-H細(xì)胞中有MAGE-1抗原的表達(dá)，且免疫組化、免疫熒光、WesternBlotting的結(jié)果是相一致的。結(jié)論：MHCC97-H細(xì)胞中有MAGE-1抗原的表達(dá)，為后面的用腫瘤特異性抗原MAGE-1與熱休克蛋白HSP70融合蛋白疫苗(M1H)預(yù)防肝癌的轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)二：MAGE1-HSP70融合蛋白的衍生化
　　目的：為了提高大分子蛋白的載藥量，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室

7、已經(jīng)純化的腫瘤特異性抗原M1H融合蛋白進(jìn)行衍生化。方法：運(yùn)用化學(xué)合成方法將腫瘤特異性抗原融合蛋白M1H與棕櫚酸交聯(lián)，使融合蛋白酯化后能更容易進(jìn)行納米包裹。結(jié)果：成功制備了衍生化M1H融合蛋白。結(jié)論：衍生化M1H融合蛋白的成功制備，為下一步用納米脂質(zhì)體包裹腫瘤特異性抗原MAGE-1與熱休克蛋白HSP70融合蛋白奠定了基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)三：免疫重建荷人高轉(zhuǎn)移肝癌SCID鼠模型的建立及其鑒定
　　目的：建立具有人免疫學(xué)特性的高轉(zhuǎn)移肝

8、癌SCID鼠模型。方法：SCID小鼠腹腔注射人外周血淋巴細(xì)胞，皮下接種人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞MHCC97-H，免疫重建人高轉(zhuǎn)移肝癌SCID小鼠模型，并鑒定建立的結(jié)果。結(jié)果：(1)免疫重建荷人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞小鼠的成瘤率為100％,較荷瘤組成瘤潛伏期延長(zhǎng)，體積縮小(p<0.05)；荷瘤組和人化荷瘤組的肝臟轉(zhuǎn)移率分別為82.5％(5/6)和67％(4/6)，人化荷瘤組從皮下轉(zhuǎn)移到肝臟所需時(shí)間較荷瘤組延長(zhǎng)(p<0.05)。(2)第2、4、6周小鼠血中

9、人IgG含量的測(cè)定：同期相比，人化荷瘤組小鼠血中人IgG含量高于人化組(p<0.05)。(3)第6周SCID小鼠外周血中人CD3+T淋巴細(xì)胞和人CD20+B淋巴細(xì)胞含量的測(cè)定：人化荷瘤組小鼠血中人CD3+T淋巴細(xì)胞和人CD20+B淋巴細(xì)胞含量高于人化組(p<0.05)。(4)免疫組化檢測(cè)人化組和人化荷瘤組小鼠脾臟中存在人CD3+T淋巴細(xì)胞和CD20+B淋巴細(xì)胞。結(jié)論：成功建立免疫重建荷人高轉(zhuǎn)移肝癌SCID鼠模型，為肝癌轉(zhuǎn)移的研究及治療提