Prestin基因相關(guān)人耳聾疾病動(dòng)物模型的建立.pdf

1、哺乳動(dòng)物的聽力極為敏感,這是由于耳蝸外毛細(xì)胞(Outer Hair Cells,OHC)中有一種生物放大器。這種放大器通過外毛細(xì)胞胞體長(zhǎng)度的改變將基底膜的振動(dòng)放大100倍,從而使人聽到聲音。外毛細(xì)胞的胞體長(zhǎng)度的改變是由某種電動(dòng)蛋白驅(qū)動(dòng)的,多年來人們一直在尋找能夠引起外毛細(xì)胞胞體振蕩的電動(dòng)蛋白。在2000年P(guān)restin基因被克隆后,研究者利用基因敲除技術(shù)證明了Prestin就是內(nèi)耳外毛細(xì)胞中的電動(dòng)蛋白。Prestin是聽力放大的核心基因

2、,它與人類耳聾疾病密切相關(guān),至今已發(fā)現(xiàn)兩種引起入耳聾的Prestin點(diǎn)突變,但目前對(duì)Prestin突變的分子病理機(jī)制知之甚少。
　　 關(guān)于Prestin在人類中的突變致聾已有文獻(xiàn)報(bào)道:2003年在第2內(nèi)含子和第3外顯子(ATG)交匯處一種點(diǎn)突變(IVS2-2A/G)被發(fā)現(xiàn),它處于Prestin mRNA剪切相關(guān)的區(qū)域;2007年在第6外顯子中,發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)點(diǎn)突變(R150Q)。這兩種點(diǎn)突變均能引起人聽力的損失。
　　 鑒

3、于人類耳聾是發(fā)病率相對(duì)較高的一種疾病,利用制作相應(yīng)疾病動(dòng)物模型的方法研究治病機(jī)理具有極高的價(jià)值。我們利用基因敲入的方法,制作Prestin基因敲入小鼠模型,以期精確模擬導(dǎo)致人類耳聾疾病的Prestin基因第6號(hào)外顯子上的點(diǎn)突變(R150Q)。我們可以通過對(duì)這種小鼠模型的表型分析和研究,避免了在人體實(shí)驗(yàn)材料以及實(shí)驗(yàn)技術(shù)不可操作性的限制。本研究選擇對(duì)第6外顯子進(jìn)行特定的點(diǎn)突變(R150Q),原因是利用它不僅可以發(fā)現(xiàn)Prestin突變致聾的分

4、子病理機(jī)制,還可以在Prestin功能的基礎(chǔ)研究上有新的突破,因?yàn)镻restin蛋白在耳蝸放大功能中的基礎(chǔ)研究雖然取得了很大進(jìn)展,但也存在許多尚未解決的重要問題,我們準(zhǔn)備制作的小鼠模型將在解決這些問題中起到關(guān)鍵作用。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:第一,我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建了基因敲入的打靶載體;第二,通過電轉(zhuǎn)化的方式,把線性化好的載體電轉(zhuǎn)化到胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem cells,ES)中,用含有G418的培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)ES細(xì)胞,細(xì)胞

5、長(zhǎng)到一定的數(shù)量時(shí),收集細(xì)胞;第三,提取細(xì)胞的基因組DNA,用先前設(shè)計(jì)好的篩選引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選,如果同源重組成功,PCR就可以擴(kuò)增出特異的條帶;第四,我們把經(jīng)過篩選得到的ES細(xì)胞通過顯微注射的方式,注射到小鼠囊胚期的胚胎中,最終獲得嵌合體小鼠:第五,通過雜交來確定是否具有生殖系轉(zhuǎn)移;最后,如果得到了具有生殖系轉(zhuǎn)移的小鼠,通過雜交和自交得到純和體后代,進(jìn)行生理、生化、蛋白等方面的分析。
　　 結(jié)果:成功的制作了Prestin