干擾素α-2b突變體的分子獲得及性能分析.pdf

1、目的： 干擾素α(Interferon-α，IFN-α)是一類(lèi)重要的細(xì)胞因子，具有廣譜抗病毒、抗細(xì)胞分裂和免疫調(diào)節(jié)作用，臨床上廣泛應(yīng)用于多種病毒性疾病和腫瘤的治療。IFN作為蛋白質(zhì)類(lèi)藥物，主要存在生物半衰期短和活性不穩(wěn)定的問(wèn)題，前者要求給病人頻繁注射，后者致使藥物在大劑量長(zhǎng)期使用時(shí)產(chǎn)生較大副作用，因此開(kāi)發(fā)長(zhǎng)效和高效的IFN是目前的發(fā)展方向。 通過(guò)改變分子內(nèi)蛋白酶水解位點(diǎn)可以影響IFN的性能。本研究在分析IFNα-2b分子

2、結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，選擇處于非受體結(jié)合位點(diǎn)、位于空間結(jié)構(gòu)表面且非保守序列的糜蛋白酶和谷氨酸-C內(nèi)蛋白酶水解位點(diǎn)作為突變點(diǎn)，分別將第58位谷氨酸、第89位酪氨酸和第159位谷氨酸通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)采用組氨酸進(jìn)行置換。經(jīng)Percent Accepted Mutation Matrix分析認(rèn)為這三個(gè)位點(diǎn)被組氨酸置換后在進(jìn)化上不會(huì)造成太大的差異，且不會(huì)產(chǎn)生新的蛋白酶的酶切位點(diǎn)。通過(guò)此結(jié)構(gòu)改建，期望獲得活性增高、分子更加穩(wěn)定的新型IFNα-2b突變體。本

3、研究的目的之一是從分子水平改變IFN，構(gòu)建兩條突變體分子：突變體1：IFNα-2bHis58；突變體2：IFNα-2bHis89/His159。 通過(guò)克隆IFNα-2b兩突變體基因，并保留未突變的IFNα-2b基因，以便于從生物學(xué)活性及體內(nèi)穩(wěn)定性上對(duì)三者進(jìn)行比較，探討能否通過(guò)這一方法達(dá)到保證和改善必需的生物活性的同時(shí)改善IFN在血液中的穩(wěn)定性，這是本研究的目的之二。 方法與結(jié)果： 1、IFNα-2b及其兩突變體基

4、因的克隆與構(gòu)建 本課題利用定點(diǎn)突變PCR的方法，將IFNα-2b分子上第58位Glu突變?yōu)镠is，得到IFNα-2b突變體1：IFNα-2bHis58；將IFNα-2b分子上第89位Tyr突變?yōu)镠is，第159位Glu突變?yōu)镠is，得到IFNα-2b突變體2：IFNα-2bHis89/His159。為了進(jìn)行比較，同時(shí)擴(kuò)增了未突變的IFNα-2b基因。將擴(kuò)增的這三段基因和原核表達(dá)載體pET23b分別用NdeI和EcoR I雙酶切，

5、再用T4DNA連接酶將pET23b與三段基因分別連接，所得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，進(jìn)行篩選鑒定。 三個(gè)重組質(zhì)粒經(jīng)NdeI和EcoR I雙酶切鑒定表明在500bp處有一特異性條帶，這與兩條分子的DNA序列的大小501bp相符；菌體PCR表明成功轉(zhuǎn)化，為陽(yáng)性克??；重組質(zhì)粒經(jīng)DNA序列測(cè)定表明，其核苷酸序列和預(yù)期結(jié)果一致，證實(shí)三段基因均正確插入質(zhì)粒中，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。 2、IFNα-2b及其兩突變體蛋白

6、的表達(dá)及純化 含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)經(jīng)小量培養(yǎng)后，采用搖瓶培養(yǎng)大量制備IFNα-2b及其突變體蛋白。搖瓶培養(yǎng)結(jié)束后離心收集并洗滌菌體，采用超聲破菌的方式獲得包涵體。包涵體經(jīng)洗滌、增溶后，用7mol/L的鹽酸胍變性，用硼酸鹽緩沖液復(fù)性，復(fù)性液透析后，先后經(jīng)陰離子交換層析和陽(yáng)離子交換層析，得到較純的IFNα-2b及其突變體蛋白。 用15％還原性SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)量，目的蛋白的表達(dá)量大于40％，主要

7、以包涵體的形式存在，表達(dá)產(chǎn)物的分子量在20KDa左右，這與IFNα-2b的理論分子量相符。經(jīng)15％非還原性SDS-PAGE電泳檢測(cè)表明純度在95％以上。 3、IFNα-2b及其突變體的質(zhì)量檢測(cè) IFNα-2b突變體的分子量采用基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜法測(cè)量；IFNα-2b及其突變體的濃度采用Lowry法測(cè)定；采用細(xì)胞病變抑制法(CPE)測(cè)定IFNα-2b及其突變體的生物活性，計(jì)算其比活性。 結(jié)果：IFNα

8、-2bHis58的分子量為19239.98，與其理論分子量完全相符；IFNα-2b比活性大于1.68×108IU/mg、IFNα-2bHis58比活性大于3.46×108IU/mg、IFNα-2bHis89/His159的比活性大于2.80×108IU/mg。由測(cè)活結(jié)果得知IFNα-2bHis58的活性較突變前提高一倍多，IFNα-2bHis89/His159的活性也較突變前有所提高。 4、IFNα-2b及其突變體的初步藥代動(dòng)力

9、學(xué)試驗(yàn) 以SD大鼠進(jìn)行初步藥代動(dòng)力學(xué)研究，三種IFN各為一組，每組六只大鼠，經(jīng)皮下注射給藥2.5×107IU/kg，按設(shè)計(jì)好的時(shí)間點(diǎn)經(jīng)鼠尾靜脈取血，用CPE法檢測(cè)各血清樣品中IFN的保留活性，繪制血藥活性-時(shí)間曲線，采用DAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，分析藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。 結(jié)果：表明IFNα-2b的t1/2β為1.72h，IFNα-2bHis58的t1/2β為2.30h，IFNα-2bHis89/Hjs159的t1/2β為2.3

10、4h，半衰期較突變前略有延長(zhǎng)。 結(jié)論： 1、本研究采用分子生物學(xué)、生物信息學(xué)和計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的辦法設(shè)計(jì)了2條IFNα-2b突變體分子，成功構(gòu)建了IFNα-2b突變體基因，并完成了工程菌構(gòu)建。 2、確定了IFNα-2b突變體的培養(yǎng)條件，包涵體的表達(dá)量在40％以上。 3、摸索到了IFNα-2b突變體的分離純化工藝，流程簡(jiǎn)單，得率較高，純度達(dá)到95％以上。為IFNα-2b的生產(chǎn)探索到了簡(jiǎn)單的方法。 4、