利用RNA干擾技術(shù)獲得水稻生育酚缺失突變體的研究.pdf

1、生育酚是一類(lèi)僅能在植物、藻類(lèi)等光合生物體內(nèi)合成，為人體和動(dòng)物所必需的維生素E重要組分。作為一種重要的脂溶性抗氧化劑，生育酚的抗氧化功能已經(jīng)在體外模型和動(dòng)物體內(nèi)得以證實(shí)，但其在植物體內(nèi)的具體功能還不是完全清楚。近年來(lái)研究顯示，生育酚還具有抗氧化作用以外的其他更為重要功能。為了進(jìn)一步研究植物體內(nèi)生育酚的生理功能，我們選擇水稻為材料，利用RNA干擾獲取葉片生育酚合成抑制甚至缺失的突變體，為全面認(rèn)識(shí)生育酚的功能奠定基礎(chǔ)。本研究構(gòu)建了水稻生育酚環(huán)

2、化酶基因RNA干擾表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻成熟胚來(lái)源的愈傷組織。經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)再生，獲得抗性再生植株。利用HPLC方法測(cè)定葉片中生育酚的含量，并對(duì)生育酚合成抑制程度不同的植株進(jìn)行表型和生理特性分析。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　 ⑴生育酚環(huán)化酶基因RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建：提取水稻總RNA，以特異性引物RT-PCR，擴(kuò)增得到500 bp大小的基因干擾片段。通過(guò)設(shè)計(jì)的兩組雙酶切，分別正向、反向連入中間載體pSTARLING

3、質(zhì)粒的cre內(nèi)含子兩側(cè)，構(gòu)建RNA干擾表達(dá)盒。通過(guò)Not I酶切，將該表達(dá)盒插入到植物雙元表達(dá)載體pWbvec8的Not I位點(diǎn)上，成功構(gòu)建了RNA干擾表達(dá)載體。
　　 ⑵農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化：凍融法將表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，用于侵染由水稻成熟胚來(lái)源的愈傷組織。確定較為合適的侵染條件為：農(nóng)桿菌菌液濃度OD600為0.5，侵染時(shí)間20 min。經(jīng)過(guò)3 d共培養(yǎng)后，進(jìn)行兩輪的潮霉素抗性篩選，共獲得抗性再生愈傷

4、組織塊93個(gè)，抗性再生率為18.1％。后經(jīng)預(yù)分化和分化培養(yǎng)，共獲得抗性植株78株，移栽溫室土壤培養(yǎng)成活57株。
　　 ⑶抗性植株生育酚含量測(cè)定及表型、生理特征分析：利用HPLC方法分析57株抗性植株葉片生育酚的含量，證實(shí)全部再生植株均為陽(yáng)性。與野生型植株葉片生育酚含量相比，抗性植株體內(nèi)含量在0.1％～75％。其中生育酚合成抑制程度較高，含量?jī)H為野生型5％以下的植株有30株，約占總體的52.6％。對(duì)RNA干擾植株的株高，光合速率，