蜈蚣三七對(duì)癌細(xì)胞增值抑制作用及機(jī)理的初探.pdf

1、背景和目的:癌癥是危害人類生命和健康最嚴(yán)重的一類疾病，抗癌藥物的研究一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，隨著分子生物學(xué)和分子藥理學(xué)對(duì)腫瘤本質(zhì)和作用機(jī)制方面的闡述，中藥抗腫瘤的研究水平也有了顯著提高并展示出了廣闊的前景。目前雖有多種治療方法，臨床治療腫瘤西醫(yī)一般采用手術(shù)、放療、化療三大療法，療效快捷，有五年生存率之說，但往往有明顯的損傷和毒副作用?？傮w而言，綜合治療是腫瘤治療的根本原則。而中醫(yī)一般采用扶正祛邪、活血化瘀、清熱解毒三大治則，講究辨證論治，

2、雖然對(duì)局灶的縮小或消除效果緩慢，但能改善機(jī)體的整體條件，其在抑制、殺傷腫瘤細(xì)胞，改善癥狀與體征，以及減輕放化療不良反應(yīng)等方面，都發(fā)揮著重要作用。因此，中醫(yī)藥防治腫瘤將成為未來抗腫瘤研究的發(fā)展趨勢，對(duì)晚期癌癥患者，可以采用中藥治療；對(duì)癌癥患者身體體質(zhì)無法接受放化療者，可以選擇中藥治療；對(duì)手術(shù)，放化療患者身體體質(zhì)產(chǎn)生損害和毒副作用者可以用中藥提高體質(zhì)，增強(qiáng)免疫力。研究中醫(yī)藥可以取各家之長，逐步走向多學(xué)科合作的、宏觀與微觀相結(jié)合的現(xiàn)代中醫(yī)藥學(xué)

3、道路。目前，祖國傳統(tǒng)中藥在腫瘤的治療方面已取得了令人注目的成就，大力開展中醫(yī)藥治療腫瘤的研究是一個(gè)非常有意義的探索。
　　 蜈蚣三七提取物特點(diǎn)是：療效好但毒性很小。過去的研究已經(jīng)證實(shí)，該提取物作用的靶器官是胸腺和腎上腺，可上調(diào)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠外周血免疫抑制性受體CTLA-4、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡因子Fas以及調(diào)節(jié)因子IL-10、IL-4、IFN-γ的表達(dá)水平，而對(duì)正常小鼠(除IFN-γ)外周血上述因子的表達(dá)水平無顯著影響；其能上調(diào)由

4、刀豆素(ConA)誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞Fas mRNA的表達(dá)水平，使CTLA-4 mRNA水平恢復(fù)正常，蜈蚣三七提取物是新發(fā)現(xiàn)的具有改善類風(fēng)濕性疾病病程作用的藥物。
　　 大量的試驗(yàn)研究證明毛茛科銀蓮花屬植物有較好抗癌活性，活性成分和作用機(jī)制已經(jīng)被試驗(yàn)證明。蜈蚣三七為銀蓮花屬，目前我們已經(jīng)從蜈蚣三七中提取總皂苷成分，以此我們通過本次試驗(yàn)對(duì)其抗腫瘤作用進(jìn)行研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)以蜈蚣三七總苷、純化蜈蚣三七總苷以及齊墩果酸三種藥

5、物，作用于人宮頸癌Siha細(xì)胞、人肝癌Hep3B細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞、HEL人胚肺細(xì)胞，進(jìn)行體外抗腫瘤研究，探討中藥成分或單體的作用機(jī)理。并根據(jù)細(xì)胞毒性最小，藥物劑量最佳的原則從多次實(shí)驗(yàn)中篩選出最佳藥物濃度劑量，為進(jìn)一步研究蜈蚣三七成分的藥理學(xué)毒性及開發(fā)新藥提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.藥物分組：本實(shí)驗(yàn)分為6個(gè)組，分別為蜈蚣三七總苷、純化蜈蚣三七總苷以及齊墩果酸，同時(shí)設(shè)立陽性藥物對(duì)照組(順鉑)、DMSO組

6、、空白對(duì)照組(未加藥組)。
　　 2.采用噻唑藍(lán)(MTT)還原法測定各實(shí)驗(yàn)組對(duì)Siha細(xì)胞、Hep3B細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、HEL細(xì)胞的生長抑制率。
　　 3.倒置顯微鏡觀察各組藥物作用于Siha細(xì)胞、Hep3B細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、HEL細(xì)胞48h后的形態(tài)學(xué)變化。
　　 4.透射電鏡進(jìn)行細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察。
　　 5.流式細(xì)胞儀檢測各組藥物作用后Siha細(xì)胞的細(xì)胞周期分布和凋亡率。
　　 6.統(tǒng)計(jì)

7、學(xué)分析。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS15.0分析，用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，X2檢驗(yàn)對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，如有差異，多組間參數(shù)兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。(1)Y軸為細(xì)胞存活率，X軸為藥物濃度，制作細(xì)胞生長曲線。(2)利用公式計(jì)算細(xì)胞48小時(shí)細(xì)胞增殖抑制率。(3)通過EXCEL畫圖法做趨勢線來求48小時(shí)IC50值。
　　 結(jié)果：
　　 1.不同濃度不同藥物分組的四種藥物作用于體外培養(yǎng)的Siha細(xì)胞、Hep3B細(xì)胞、He

8、pG2細(xì)胞、HEL細(xì)胞48h后，各實(shí)驗(yàn)組生長抑制率結(jié)果如下：
　　 1.1 Siha細(xì)胞：純化蜈蚣三七總苷藥抑制作用最強(qiáng)(IC50=28.89ug/ml)，蜈蚣三七總苷藥次之(IC50=39.64ug/ml)，齊墩果酸藥最弱(IC50=14.89ug/ml)。
　　 1.2 Hep3B細(xì)胞：純化蜈蚣三七總苷(IC50=21.08 ug/ml)和蜈蚣三七總苷藥(IC50=84.10ug/ml)的抑制作用相當(dāng)，齊墩果酸藥最弱

9、(IC50=19.75ug/ml)。
　　 1.3 HepG2細(xì)胞：齊墩果酸藥抑制作用最強(qiáng)(IC50=25.51ug/ml)，蜈蚣三七總苷藥次之(IC50=89.70ug/ml)，純化蜈蚣三七總苷藥最弱(IC50=54.21ug/ml)。
　　 1.4 HEL細(xì)胞：純化蜈蚣三七總苷、蜈蚣三七總苷、齊墩果酸對(duì)HEL細(xì)胞一直作用不明顯。
　　 2.藥物作用后，Siha細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。倒置顯微鏡下觀察到：對(duì)照組：Si

10、ha細(xì)胞貼壁生長，彌散蔓延分布，呈紡錘形或多角形，細(xì)胞透亮，生長狀態(tài)良好。
　　 實(shí)驗(yàn)組：細(xì)胞相互分離，透亮度差，貼壁大量減少，體積明顯縮小，細(xì)胞縮小，可見大量細(xì)胞崩解碎片，細(xì)胞核縮小或崩解消失。
　　 3.電鏡進(jìn)行細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察，用藥后的細(xì)胞肌漿網(wǎng)明顯擴(kuò)張呈空泡狀，線粒體腫脹、結(jié)構(gòu)破壞，嵴紊亂、稀疏。
　　 4.流式細(xì)胞儀檢測Siha細(xì)胞的凋亡率。體外培養(yǎng)的Siha細(xì)胞經(jīng)藥物作用后，細(xì)胞出現(xiàn)早期細(xì)胞凋亡、晚期

11、細(xì)胞凋亡或者壞死。
　　 結(jié)論：
　　 1.蜈蚣三七總苷藥對(duì)Hep3B細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)，對(duì)Siha細(xì)胞抑制作用次之、HepG2細(xì)胞抑制作用相對(duì)較弱。
　　 2.純化蜈蚣三七總苷藥對(duì)Siha細(xì)胞抑制作用較強(qiáng)，對(duì)Hep3B細(xì)胞抑制作用次之，HepG2細(xì)胞抑制作用相對(duì)較弱。
　　 3.齊墩果酸藥對(duì)HepG2細(xì)胞抑制作用較強(qiáng)，Hep3B、HepG2細(xì)胞抑制作用相對(duì)較弱。
　　 4.蜈蚣三七總苷、純化蜈蚣三