樹突狀細(xì)胞與CRP在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系及機(jī)制研究.pdf

1、背景/意義: 冠心?。╟oronary heart disease，CHD）是目前威脅全人類健康和生命的主要疾病之一，由于其發(fā)病機(jī)制尚不明確，成為診斷和治療的重大障礙。針對其發(fā)病機(jī)制的研究，不僅一直是眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)，而且有利于降低CHD的發(fā)病率和死亡率。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是CHD的病理改變基礎(chǔ)。AS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其發(fā)展過程主要經(jīng)歷脂紋、脂斑、纖維斑塊、粥樣硬化斑塊等逐漸進(jìn)展時(shí)期，具有緩慢進(jìn)

2、展的特點(diǎn)，但AS的發(fā)病機(jī)制仍未十分明確。近年來，炎癥免疫反應(yīng)在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到關(guān)注，其理論的核心是：在動脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素等抗原的刺激下，激活T淋巴細(xì)胞，引起的一系列特異性細(xì)胞免疫及體液免疫反應(yīng)，進(jìn)一步激活效應(yīng)細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、血小板和平滑肌細(xì)胞，從而導(dǎo)致炎性產(chǎn)物的劇烈增加，促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展和斑塊的破裂。 最近幾年研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)具有最重要的抗原提呈和免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的樹突狀細(xì)胞（dendritic c

3、ells，DCs）在動脈粥樣硬化斑塊形成、發(fā)展中的作用受到廣泛關(guān)注。最近的研究提出，DCs在動脈粥樣硬化的早期和晚期都有數(shù)量和功能的改變，尤其是DCs可能與冠心病晚期急劇進(jìn)展有關(guān)。C反應(yīng)蛋白（C reaetive Protein，CRP）是當(dāng)前備受關(guān)注的動脈粥樣硬化炎癥標(biāo)志物之一，在預(yù)測AS導(dǎo)致的各種心腦血管事件中具有重要的價(jià)值。近年來，較多的體外研究證據(jù)表明CRP損傷血管平滑肌細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中起著直

4、接／間接的作用，以CRP作為治療靶點(diǎn)已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。目前國內(nèi)外關(guān)于CRP與DCs的關(guān)系尚未明確報(bào)道。針對國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀，本文提出以下問題：1．DCs的分型和功能與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，但是與AS的斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系，尚無明確報(bào)道。2．CRP在促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，但是，CRP與DCs是否存在密切關(guān)系，還需要進(jìn)一步的流行病學(xué)調(diào)查。3．CRP是否是DCs功能發(fā)生改變的因素之一，CRP誘導(dǎo)DCs改變的可能機(jī)制是什

5、么？鑒于DCs和CRP在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要作用，本課題在以往研究的基礎(chǔ)上，首先采用臨床病例對照研究，利用流式細(xì)胞等技術(shù)對不同的冠心病患者的外周血樹突狀細(xì)胞的分型和功能進(jìn)行檢測，利用血管內(nèi)超聲檢測冠狀動脈斑塊的性質(zhì)，試圖說明DCs與動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定系的關(guān)系，以及利用多種分子生物學(xué)技術(shù)從細(xì)胞水平上探討CRP與DCs的關(guān)系及其相關(guān)機(jī)制。本課題的研究結(jié)果將為指導(dǎo)臨床上診斷不穩(wěn)定心絞痛提供了新的標(biāo)志物，并且為明確CRP和DCs在動脈粥

6、樣硬化中的關(guān)系提供了可靠的實(shí)驗(yàn)室資料，為闡明AS的發(fā)病機(jī)制提供了一條新的方向。 全文主要分2個(gè)部分來闡明。 方法和內(nèi)容: 第一部分、不同冠心病患者外周血樹突狀細(xì)胞分型及功能檢測。 目的：本研究根據(jù)患者臨床情況、冠脈造影和血管內(nèi)超聲（intravascular ultra-sound，IVUS）診斷冠心病和斑塊的穩(wěn)定性，研究不同類型和不同性質(zhì)斑塊冠心病患者外周循環(huán)中DCs數(shù)量和功能的變化，探討DCs與冠脈粥

7、樣硬化斑塊從穩(wěn)定到到“易損”的關(guān)系，以期早期發(fā)現(xiàn)易損斑塊，指導(dǎo)臨床診治。 方法：入選病例總共80例，其中AMI組15例、UAP（CTNI+）組15例、UAP（CTNI-）組15例、SAP組17例、CTL18例，一般臨床資料的比較顯示：各組的年齡、性別比例相比差異無顯著性意義（P>0．05）。各組中主要的心血管病危險(xiǎn)因素，如：吸煙（Smoking）、高血壓（Hypertension）、血糖（Diabetes mellitus）、總

8、膽固醇（Total cholesterol）、甘油三脂（Triglyceride）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL cholesterol）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL cholesterol）等，相互之間的比較差異無顯著性意義（p>0．05），將冠心病按穩(wěn)定心絞痛、肌鈣蛋白陰性不穩(wěn)定心絞痛（不存在著心肌壞死）、肌鈣蛋白陽性不穩(wěn)定心絞痛（心肌壞死標(biāo)記物輕度升高，存在著少量心肌細(xì)胞壞死）、急性心肌梗死分型，能較好的反應(yīng)冠脈粥樣斑塊從穩(wěn)定-炎癥

9、反應(yīng)增強(qiáng)-斑塊破裂-微小血栓形成-大血栓形成-相關(guān)血管閉塞的病理生理過程，即斑塊從穩(wěn)定到易損的過程。SAP、UAP（CTNI-）、UAP（CTNI+）組各10例患者行IVUS檢查，根據(jù)IVUS表現(xiàn)分為破裂斑塊組（7例）、不穩(wěn)定斑塊組（12例）和穩(wěn)定斑塊組（11例）；流式細(xì)胞4色分析法檢測DCs亞型前提的比例；流式細(xì)胞儀、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等分子生物技術(shù)測定DCs功能。 結(jié)論： 1．冠心病不同階段，外周血DCs

10、數(shù)量和比例的改變不同。在斑塊從不穩(wěn)定到“易損”的進(jìn)展中，數(shù)量、比例從經(jīng)歷了正常-顯著升高-減少的過程。 2．本研究分組SAP-UAP（CTNI-）-UAP（CTNI+）可大致體現(xiàn)冠狀動脈斑塊從穩(wěn)定-炎癥反應(yīng)增強(qiáng)-斑塊破裂的病理生理過程。 不穩(wěn)定斑塊組mDCss的占外周血白細(xì)胞比例及絕對數(shù)均比穩(wěn)定斑塊組顯著增多；破裂斑塊組患者的mDCs、pDCs比例及絕對數(shù)均顯著減少，mDC2s比例、數(shù)量無顯著變化。提示外周血DCs數(shù)量、

11、比例反應(yīng)斑塊性質(zhì)，DCs與斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)。 3．在冠狀動脈斑塊的穩(wěn)定性改變過程中，DCsCD86表型不斷增高，刺激淋巴細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，炎癥因子INF-a、IL-12分泌增加。 4．不同階段冠心病患者PBMC源性DCsCD86表達(dá)、刺激淋巴細(xì)胞增殖能力與血漿hs-CRP和IL-6水平成正相關(guān)。 因此，冠心病患者外周血DCs數(shù)量、功能變化提現(xiàn)斑塊的穩(wěn)定性變化，在不存在造血功能異常的條件下，檢測冠心病外周血DCs數(shù)

12、量、比例及功能可以一定程度反應(yīng)冠心病患者冠脈斑塊穩(wěn)定性，可用于指導(dǎo)冠心病的分型及判別斑塊性質(zhì)。 第二部分、CRP對樹突狀細(xì)胞分化成熟及機(jī)制研究。 目的：CRP對DCs分化過程中功能的影響，從而探討DCs和CRP的關(guān)系以及相關(guān)機(jī)制。 方法：分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，在含重組人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF，100ng/ml）和重組人白細(xì)胞介素-4（rhIL-4，20ng/ml）的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)；根據(jù)不同

13、的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行分組，主要分成3個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。目?：觀察不同濃度CRP對DC細(xì)胞功能的影響；分成3組：①對照組；②CRP組：分別在細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入濃度為0．6、2、6、20和60μg/mL的CRP；③LPS組：加入含（0．1 μg/mL）LPS的100μl，使終濃度為1 mg/L；目的2：觀察不同干預(yù)因素對DCs細(xì)胞功能的影響；主要分成①對照組；②CRP組：分別在細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入濃度為20和60μg/mL的CRP；③CRP+CD3

14、2組（20μg/mL）：預(yù)先加入含有CD3220μg/mL的PBS溶液100μl，6小時(shí)加入60μg/mL的CRP，共同孵育24小時(shí)。目的3：觀察不同濃度CRP和不同干預(yù)因素對DCs表達(dá)CCR7的影響。①對照組；②CRP組：分別在細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入濃度為20μg/mL和60μg/mL的CRP；③CRP+CD32組（μg/mL）：預(yù)先加入含有CD3220μg/mL的PBS溶液100μl，6小時(shí)加入60μg/mL的CRP，共同孵育24小時(shí)

15、。④預(yù)先加入抗CD32特異的抗體6小時(shí)，檢測DCs中CCR7的含量。主要采用流式細(xì)胞術(shù)檢測DCs中CD1a、CD83、CD86、HLA-DR、CCR7表型；以DCs為刺激細(xì)胞、刺激同種異體T淋巴細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞按比例混合后，以混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度觀察對DCs抗原遞呈和淋巴細(xì)胞增殖的影響；ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子濃度；RT-PCR和蛋白電泳分別檢測DCs中CCR7的表達(dá)。 結(jié)論：CRP具有促進(jìn)人單核細(xì)胞來源的DC表型改變