RNA干擾Nodal基因?qū)θ宋赶侔┌┘?xì)胞MNK-45凋亡及血管生成的影響_3560.pdf

1、分類號(hào)：密級(jí)：UDC：學(xué)號(hào)：T104112012021060南昌大學(xué)同等學(xué)力申請(qǐng)碩士學(xué)位研究生南昌大學(xué)同等學(xué)力申請(qǐng)碩士學(xué)位研究生學(xué)位論文RNRNA干擾NodaNodal基因?qū)θ宋赶侔┌┘?xì)基因?qū)θ宋赶侔┌┘?xì)胞MNK4MNK45凋亡及凋亡及血管生成的影響血管生成的影響EffectsofRNAinterferenceNodalgeneonapoptosisangiogenesisingastriccancercells余潔麗余潔麗培養(yǎng)單位（院

2、、系）：江西省人民醫(yī)院指導(dǎo)教師姓名、職稱：姚偉榮主任醫(yī)師申請(qǐng)學(xué)位的學(xué)科門類：醫(yī)學(xué)碩士學(xué)科專業(yè)名稱：腫瘤學(xué)論文答辯日期：2017年5月答辯委員會(huì)主席：評(píng)閱人：2017年5月摘要II摘要目的目的：構(gòu)建并鑒定Nodal基因的RNAi慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人胃腺癌癌細(xì)胞MNK45，沉默人胃腺癌癌細(xì)胞MNK45中Nodal，探討Nodal基因?qū)θ宋赶侔┌┘?xì)胞MNK45凋亡及血管生成的影響。方法方法：1）針對(duì)NodalmRNA設(shè)計(jì)合成3條siRNA，

3、及設(shè)計(jì)1條陰性對(duì)照siRNA。退火形成雙鏈DNA，與熒光載體（GV248）連接，對(duì)構(gòu)建的3個(gè)重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，如測(cè)定序列與目的序列一致，提示插入Nodal基因RNAi序列正確。2）對(duì)重組慢病毒載體進(jìn)行包裝及鑒定，對(duì)測(cè)序正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提并與3種質(zhì)粒載體（重組質(zhì)粒及pHelper1.0、pHelper2.0）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后96h，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，測(cè)定病毒滴度。3）將慢病毒感染人胃腺癌細(xì)胞MNK45。感

4、染72h后，進(jìn)行熒光倒置顯微鏡觀察感染效率。qPCR檢測(cè)Nodal基因的表達(dá)。4）shRNA慢病毒感染MKN45細(xì)胞，培養(yǎng)5天后，使用eBioscience的凋亡檢測(cè)試劑盒及流氏細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。5）采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）三維培養(yǎng)法分析慢病毒感染MKN45細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)血管形成的影響。Cellomics儀觀察人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）血管面積、平均血管長(zhǎng)度、平均血管寬度、血管節(jié)點(diǎn)數(shù)來(lái)評(píng)估血管生成情況。結(jié)果：結(jié)果

5、：（1）重組慢病毒載體的測(cè)序：對(duì)構(gòu)建的3個(gè)重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，測(cè)定序列與目的序列一致。提示插入Nodal基因RNAi序列正確。（2）重組慢病毒載體的包裝及鑒定：將3種質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后96h，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，見細(xì)胞生長(zhǎng)良好，熒光強(qiáng)烈。測(cè)定病毒滴度為5108TUml。（3）qPCR檢測(cè)RNA干擾后Nodal基因的表達(dá)：RNAi慢病毒感染后，MKN45細(xì)胞Nodal基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)。LVNODALRNAi

6、(447871)感染、LVNODALRNAi(447891)感染分別下調(diào)了80.3%和84.9%。(4)RNA干擾Nodal基因?qū)KN45細(xì)胞凋亡的影響:shRNA慢病毒感染MKN45細(xì)胞，培養(yǎng)5天后，干擾組凋亡率與對(duì)照組比較明顯升高（P＜0.05）。(5)對(duì)體外HUVEC細(xì)胞血管生成的影響:96孔板中鋪Matrigel，用收集的目的細(xì)胞培養(yǎng)上清液重懸HUVEC細(xì)胞，鋪96孔板。培養(yǎng)后加入CalceinAM，室溫孵育。與對(duì)照組比較，實(shí)