整合素α-,5-β-,1-，細胞外信號調節(jié)激酶和蛋白激酶C在纖維粘連蛋白碎片誘導髓核細胞退變過程中的作用.pdf

1、間盤退變是一個復雜的過程，多種因素參與了間盤退變的過程。纖維粘連蛋白是一種存在于間盤細胞外基質內的糖蛋白，其可以被基質金屬蛋白酶(MMP)分解為纖維粘連蛋白碎片(Fn—f)。研究表明，F(xiàn)n—f在退變間盤的含量明顯增加，且Fn—f有誘導間盤退變的作用。如果將Fn—f注入正常的間盤內，間盤出現(xiàn)退變樣改變，而如果將Fn—f加入髓核細胞的培養(yǎng)液中，髓核細胞同樣發(fā)生退變。而且已證明纖維粘連蛋白和Fn—f在細胞膜上主要的受體是整合素α5β1。但是目

2、前對于Fn—f誘導髓核細胞退變的具體機制并不清楚。 整合素是一組細胞表面的黏附分子，是多種基質蛋白的膜受體，其可以參與細胞的信號傳導，調控基因表達、細胞周期和細胞凋亡。研究表明整合素α1，α5，αv，β1，β3在正常人間盤組織內表達，這些整合素亞基在間盤內可以起到力學傳導器和基質蛋白受體等作用。整合素有力學傳感器的作用，其可以在細胞把力學信號轉化為化學信號的過程中發(fā)揮作用。且整合素可以與間盤內多種基質蛋白相互作用，如α1β1亞單

3、位是膠原蛋白在間盤細胞膜上的主要受體，而α5β1亞單位是纖維結合蛋白的膜受體。然而目前并不清楚整合素在退變間盤內的表達情況，而且同樣不清楚整合素α5β1在Fn—f誘導髓核細胞退變的過程中起到何種作用。 細胞外信號調節(jié)激酶1和2(ERK1/2)和蛋白激酶C(PKC)是兩種重要的信號傳導蛋白。已有研究表明ERK和PKC在間盤的退變過程中發(fā)揮作用，而且ERK和PKC在Fn—f誘導軟骨細胞退變的過程起到了信號傳導的作用。那么ERK和PK

4、C在Fn—f誘導髓核細胞退變的過程是否發(fā)揮同樣的作用？ 目的： 檢測整合素α1，α5，αv，β1，β3在退變的人間盤內的表達情況。探討Fn—f加入髓核細胞培養(yǎng)液中后，整合素α5β1的表達情況和ERK1/2的活化情況。研究整合素α5β1，ERK1/2和PKC在Fn—f誘導髓核細胞退變的過程中起到的作用。 方法： 術中收集人間盤髓核標本40例，分為三組：正常組(n=10)，突出組(n=15)，脫出組(n=15

5、)。應用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和免疫沉淀技術比較整合素α1，α5，αv，β1，β3在以上三組內的表達情況，同時比較了整合素的配體—膠原蛋白(Ⅰ和Ⅱ型)和纖維粘連蛋白的表達情況。 體外分離和培養(yǎng)兔間盤髓核細胞，在培養(yǎng)液中加入110 kDa纖維粘連蛋白碎片。通過免疫印跡技術、免疫熒光技術及RT-PCR的方法，檢測整合素α5β1亞基、Ⅱ型膠原蛋白、MMP9和MMP13的表達情況。通過免疫印跡技術檢測ERK1/2的磷酸化情

6、況。然后特異性抑制整合素α5β1的表達，觀察Fn—f對髓核細胞有何影響。利用ERK1/2磷酸化的特異性抑制劑和PKC活化的特異性抑制劑來研究ERK1/2和PKC的作用。 結果： 1、整合素在人髓核組織中的表達情況 整合素α1，α5，αv，β1，β3在三組間盤都有表達。整合素α5在脫出組和突出組的表達分別是正常組的2.2倍和1.5倍。整合素β1在脫出組和突出組的含量分別是正常組的2.5倍和1.6倍。而纖維粘連蛋白在

7、退變髓核內的表達同樣有升高的趨勢。但整合素α1，αv，β3在三組內的表達沒有統(tǒng)計學差異。 2、Fn—f對于髓核細胞的影響 加入Fn—f后，髓核細胞的整合素α5和β1亞基表達明顯增加，而Ⅱ型膠原蛋白表達下降，MMP9和MMP13的表達增加，同時ERK1/2的磷酸化也明顯增強。 3、整合素α5β1在Fn—f誘導髓核細胞過程中的作用 特異性抑制整合素α5β1表達后，F(xiàn)n—f不能誘導髓核細胞退變，Ⅱ型膠原蛋白、M

8、MP9和MMP13的表達沒有變化，ERK1/2的磷酸化也并沒有被增強。 4、ERK1/2和PKC的作用 ERK1/2磷酸化的特異性抑制劑PD98059和PKC活化的特異性抑制劑GF109203X加入髓核細胞的培養(yǎng)基中后，F(xiàn)n—f誘導髓核細胞退變的作用同樣被抑制。 討論： 已有研究表明隨著間盤由突出向脫出的發(fā)展，間盤退變的程度也越來越嚴重。即隨著間盤退變進程的發(fā)展，整合素α5和β1亞基在髓核內的表達也隨之

9、增加。實驗中有意義的是纖維粘連蛋白和其受體α5和β1亞基有同樣的增加趨勢。并在進一步的實驗中證明了Fn—f可以增加其受體α5和β1亞基的表達。當然仍有很多其它因素可以影響整合素表達。缺氧環(huán)境就是整合素表達變化的重要原因之一，Risbud等發(fā)現(xiàn)在缺氧的環(huán)境下培養(yǎng)髓核細胞，可以增強細胞MAPK的活性，增加整合素亞基的表達。同樣壓力也可以影響整合素的表達，當間盤細胞在體外加壓培養(yǎng)后，某些整合素亞基的表達出現(xiàn)下降趨勢。當然以上這些實驗都是在體外

10、細胞培養(yǎng)的環(huán)境下進行的，由于體內環(huán)境與體外細胞培養(yǎng)環(huán)境有很大區(qū)別，體內多種因素共同作用于間盤造成其退變的結局，因此退變間盤內整合素表達的變化可能是這些因素共同作用的結果。 Fn—f是間盤退變過程中纖維粘連蛋白的分解產(chǎn)物，其含量在退變間盤內的含量明顯增加。究其原因有兩方面，一方面是纖維粘連蛋白在退變間盤內的表達增多，另一方面在退變過程中MMP的表達明顯增加，而正是MMP將纖維粘連蛋白分解為Fn—f。而在體內實驗和體外實驗都證明了

11、Fn—f有減少糖蛋白表達，促進基質蛋白分解的作用。本實驗中同樣證明了這個結論，F(xiàn)n—f減少了Ⅱ型膠原蛋白的表達，增加了MMP9和MMP13的表達。研究Fn—f的退變機制時，Homandberg提出Fn—f的作用由Fn—f、MMP、纖維粘連蛋白、Ⅱ型膠原蛋白組成的正反饋惡性循環(huán)，即Fn—f增加了MMP的表達，增加的MMP分解纖維粘連蛋白形成更多的Fn—f，而Ⅱ型膠原蛋白的表達減少是這個惡性循環(huán)的最終結局。而本實驗觀察到的Fn—f減少Ⅱ型膠

12、原蛋白的表達，增加MMP9和MMP13的表達正與這個理論一致。那么整合素α5β1在這個惡性循環(huán)中處于什么位置呢。在本研究中同樣發(fā)現(xiàn)Fn—f有促進整合素α5、β1亞基表達作用。由于整合素β5β1在Fn—f誘導間盤退變過程中起到了膜受體的作用，而Fn—f又有促進其受體表達增加的作用，那么Fn—f對于間盤作用的惡性循環(huán)可以做進一步的探討?？梢詫⒄纤卅?β1納入這個正反饋惡性循環(huán)，即Fn—f與髓核細胞膜上的整合素α5β1結合后，影響了髓核細胞

13、的代謝，MMP和受體整合素α5β1的表達都增加，MMP分解纖維粘連蛋白使Fn—f的量增加，而整合素α5β1表達的增加使Fn—f的結合位點增多，促進了Fn—f誘導髓核細胞退變的作用。因此，整合素α5β1既是Fn—f在間盤細胞上的受體，同時又是Fn—f誘導間盤退變的正反饋惡性循環(huán)中的關鍵環(huán)節(jié)。 ERK1/2和PKC同樣參與了Fn—f誘導髓核細胞退變的過程，ERK1/2的磷酸化在Fn—f的作用下明顯增強。而且ERK1/2磷酸化的特異

14、性抑制劑PD98059和PKC活化的特異性抑制劑GF109203X抑制了Fn—f誘導髓核細胞退變的作用。因此，可以認為ERK1/2和PKC同樣是Fn—f誘導間盤退變的正反饋惡性循環(huán)中的環(huán)節(jié)，即Fn—f與髓核細胞膜上的整合素α5β1結合后，激活細胞內信號蛋白PKC，增強了ERK1/2的磷酸化，引起蛋白表達變化，增加了整合素α5β1和MMP的表達，減低了Ⅱ型膠原蛋白的表達，增加的MMP又進一步分解纖維粘連蛋白為Fn—f。 結論：