PA-LFn轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答的初步研究.pdf

1、炭疽毒素是炭疽桿菌(Bacillus anthracis)的關(guān)鍵性致病因子，由保護(hù)性抗原(Protective antigen，PA)，水腫因子(Edema factor，EF)，致死因子(Lethal factor,LF)三種毒素因子組成，PA與宿主細(xì)胞表面的炭疽毒素受體結(jié)合經(jīng)一系列的相互作用后，LF/EF被PA輸送進(jìn)宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，從而發(fā)揮各自的毒素效應(yīng)。LFn由LF氨基端的前254aa組成，不含有LF的毒性區(qū)域，與PA具有很高的

2、親和結(jié)合力。基于炭疽毒素的分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制發(fā)展的PA/LFn轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，具有轉(zhuǎn)運(yùn)外源蛋白到胞質(zhì)中激起機(jī)體特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicity Tlymphocyte，CTL)殺傷反應(yīng)的潛力，而CTL在清除胞內(nèi)病原體和腫瘤細(xì)胞方面具有至關(guān)重要的作用。 前列腺干細(xì)胞抗原(Prostate stem cell antigen，PSCA)是Thy-1/Ly-6膜抗原家族成員之一，由123個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，具有很高的前列

3、腺組織特異性，在前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，是一種理想的前列腺癌診斷和治療靶標(biāo)。本研究選擇前列腺干細(xì)胞抗原作為靶抗原，研究PA/LFn轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤抗原免疫應(yīng)答的能力。 本研究成功構(gòu)建了pET21a-LFn-PSCA表達(dá)質(zhì)粒，并在BL21(DE3)大腸桿菌中經(jīng)1mM IPTG 28℃，220rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)6h，獲得可溶性高效表達(dá)，目的蛋白表達(dá)量占全菌蛋白的5％。經(jīng)陰離子交換層析，Ni柱親和層析和疏水層析三步純化獲得了較高純度

4、的LFn-PSCA融合蛋白，濃度為3.0mg/ml。將重組的LFn-PSCA融合蛋白與PA體外共同作用于炭疽毒素敏感細(xì)胞J774A.1小鼠巨噬細(xì)胞，結(jié)果表明重組融合蛋白對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性。體外競(jìng)爭(zhēng)抑制性實(shí)驗(yàn)表明，LFn-PSCA蛋白可競(jìng)爭(zhēng)性抑制LF和PA的結(jié)合，對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。 將LFn-PSCA和PSCA分別在PA有無(wú)的情況下免疫小鼠，然后對(duì)小鼠產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫進(jìn)行檢測(cè)。借助ELISA法檢測(cè)小鼠體液免疫應(yīng)答水平，結(jié)果表

5、明PA/LFn-PSCA混合免疫組小鼠血清抗PSCA抗體水平高于LFn-PSCA單獨(dú)免疫組，由此推斷PA可增強(qiáng)機(jī)體針對(duì)PSCA的體液免疫應(yīng)答。但具體的增強(qiáng)機(jī)制仍需進(jìn)行深入研究。采用MTT法分析LFn-PSCA體外刺激脾細(xì)胞增殖活性，發(fā)現(xiàn)PA/LFn-PSCA混合免疫組和LFn-PSCA單獨(dú)免疫組均產(chǎn)生一定的刺激指數(shù)，但二者之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p>0.05)。進(jìn)一步借助LDH法檢測(cè)PSCA特異CTL殺傷活性，結(jié)果顯示PM/LFn