RIG-Ⅰ在機(jī)體免疫反應(yīng)中的作用及其機(jī)制初步研究.pdf

1、RIG-I(Retinoic acid-inducible gene I)是全反式維甲酸ATRA (all trans-retinoicacid)誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化過程中克隆到的一個上調(diào)基因,在抗病毒反應(yīng)中起重要作用.本實驗室構(gòu)建了RIG-I基因剔除小鼠模型,并對其進(jìn)行表型分析,發(fā)現(xiàn)該基因與T淋巴細(xì)胞自穩(wěn)狀態(tài)維持和免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換相關(guān)和野生型小鼠相比,隨年齡的增加,RIG-I基因剔除小鼠體重逐漸減輕,到3個月時出現(xiàn)顯著性差異；對其各組

2、織器官進(jìn)行病理分析,結(jié)果顯示RIG-I基因剔除小鼠的胃腸出現(xiàn)不同程度的炎癥細(xì)胞侵潤,統(tǒng)計學(xué)顯示3月齡的RIG-I基因剔除小鼠均出現(xiàn)巨大肥厚性胃炎,2月齡的RIG-I基因剔除小鼠70﹪出現(xiàn)自發(fā)性腸炎樣癥狀,并隨著年齡增加侵潤程度逐步增加；菌群分析顯示RIG-I基因剔除小鼠腸道粘膜菌群改變；RIG-I基因剔除小鼠小腸的淋巴器官Peyer's Patch的數(shù)目顯著減少、體積顯著減??；TUNEL和流式分析結(jié)果顯示RIG-I基因剔除小鼠的Peye

3、r's Patch 細(xì)胞凋亡增加,但OVA(卵清白蛋白)免疫后Peyer's Patch生發(fā)中心正常形成；RIG-I基因剔除小鼠比野生型小鼠對DSS(Dextran sulfate sodium salt)易感性顯著性增加.以上結(jié)果提示RIG-I基因剔除小鼠存在顯著的免疫缺陷癥狀,本實驗對與機(jī)體炎癥反應(yīng)關(guān)系密切的T細(xì)胞做進(jìn)一步的研究。 利用EUSA進(jìn)一步分析RIG-I基因剔除小鼠免疫系統(tǒng)各個細(xì)胞類型功能學(xué)變化.檢測 RIG-I

4、基因剔除小鼠和野生型小鼠的脾臟細(xì)胞體外培養(yǎng)的上清,基礎(chǔ)狀態(tài)下,RIG-I基因剔除小鼠脾臟細(xì)胞IFN-γ吖分泌比野生型小鼠高2.5倍,IL-10沒有顯著性變化；PMA體外刺激培養(yǎng)三天后,RIG-I基因剔除小鼠脾臟細(xì)胞IFN-γ分泌比野生型小鼠高14倍,LPS刺激下IL-10分泌也顯著增加,IL-4未見顯著性改變,表明RIG-I基因剔除小鼠的脾臟細(xì)胞因子分泌發(fā)生改變；RIG-I基因剔除小鼠的T細(xì)胞亞群流式分析結(jié)果表明RIG-I基因缺失沒有影

5、響T細(xì)胞在胸腺中的發(fā)育；脾臟總的CD4+、CD8+的T細(xì)胞數(shù)量和比例未見顯著性改變,但RIG-I基因剔除小鼠中CD4+T細(xì)胞中初始T細(xì)胞(CD44<'low>CD62L<'high>)細(xì)胞比例明顯降低,CD44<'low>CD62L<'low>T細(xì)胞、效應(yīng)性T細(xì)胞(CD44<'high>CD62L<'loW>)、記憶性T細(xì)胞(CD44<'high>CD62L<'high>)顯著性增加；CD8+T細(xì)胞中初始T細(xì)胞(CD44<'low>CD

6、62L<'high>)比例顯著性降低,效應(yīng)性T細(xì)胞CD44<'high>CD62L<'loW>)比例比野生型小鼠也有顯著性升高,而雙陽性和雙陰性細(xì)胞沒有顯著性變化；TUNEL和流式結(jié)果顯示脾臟T細(xì)胞凋亡增加；胸腺和脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在數(shù)目和比例上沒有顯著性差異,但是體外抑制實驗表明RIG-.,基因剔除小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4+CD25+功能缺陷. Gai2(G pretein αinhibitory subunit)是G蛋白家族

7、的成員之一,Gai2基因剔除小鼠和.RIG-I基因剔除小鼠表型有很大的相似性,提示RIG-I和Gai2之間的相關(guān)性.RIG-I基因剔除小鼠各組織器官中Gai2有不同程度的表達(dá)降低；NB4細(xì)胞中,隨著ATRA誘導(dǎo)RIG-I基因的表達(dá)增加,Gai2亦出現(xiàn)相應(yīng)的表達(dá)增加；Luciferase實驗也表明.RIG-I對Gai2的啟動子區(qū)域有正向的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用.同時Luciferase實驗也提示RIG-I負(fù)向調(diào)控Blimp-I(B lymphocy

8、te induced maturation protein-1)啟動子的轉(zhuǎn)錄.以上結(jié)果提示.RIG-I可能通過調(diào)節(jié)Gai2和Blimp-1的轉(zhuǎn)錄,改變T細(xì)胞在外周的免疫自穩(wěn)狀態(tài),從而導(dǎo)致.RIG-I基因剔除小鼠胃腸炎的發(fā)生. 前期工作表明.RIG-I基因剔除小鼠免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換出現(xiàn)異常,本研究建立了RIG-I高表達(dá)B細(xì)胞株1B4.B6/pcDNA3.1-RIG-I,以期進(jìn)一步闡明RIG-I在免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換中的作用及其分子機(jī)

9、制. 用LPS刺激1:B4.B6/pcDNA3/1-RIG-I和對照細(xì)胞株184.B6/pcDNA3.1不同的時間段,并對各種免疫球蛋白的胚系轉(zhuǎn)錄本和類別轉(zhuǎn)換后轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了檢測.結(jié)果表明刺激前后IgM:胚系轉(zhuǎn)錄本在兩種細(xì)胞株中沒有顯著差異,在RIG-I高表達(dá)的細(xì)胞株中IgGl、IgG3胚系轉(zhuǎn)錄本增強(qiáng),IgG3類別轉(zhuǎn)換后轉(zhuǎn)錄本顯著性增強(qiáng)；p50在IgG3類別轉(zhuǎn)化事件中起關(guān)鍵性作用,檢測結(jié)果顯示和對照細(xì)胞株相比,184.B6/pcD

10、NA3.1-RIG-I細(xì)胞中p50蛋白水平增強(qiáng),提示RIG-I對p50蛋白水平有調(diào)節(jié)作用；免疫共沉淀顯示RIG-I蛋白和p50蛋白之間存在相互作用；RIG-I主要定位在細(xì)胞質(zhì)中,EGFP示蹤實驗發(fā)現(xiàn)RIG-I也存在細(xì)胞核中；RIG-I過表達(dá)使1B4.B6細(xì)胞中CD138單陽性細(xì)胞的比例降低,但CD138+細(xì)胞中分泌IgG3的細(xì)胞比例顯著增加；MTT結(jié)果顯示RIG-I抑制1B4.B6細(xì)胞的增殖；流式結(jié)果同樣顯示RIG-I基因高表達(dá)改變細(xì)胞

11、生長周期.本部分研究顯示RIG-I高表達(dá)上調(diào)p50蛋白水平并和其相互作用促進(jìn)免疫球蛋白IgG3類別轉(zhuǎn)換事件的發(fā)生.同時顯示RIG-I高表達(dá)增強(qiáng)B細(xì)胞分泌IgG3的能力不是通過加快細(xì)胞增殖來完成的. 進(jìn)一步對RIG-I基因剔除小鼠骨髓細(xì)胞基因芯片結(jié)果分析表明.RIG-I基因的缺失引起免疫防御、細(xì)胞周期、免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換、物質(zhì)代謝等方面基因的轉(zhuǎn)錄改變,對RIG-I基因剔除小鼠的相應(yīng)表型可以做一定的解釋. 本研究首次報道RI